川芎嗪对人肝癌细胞钙激活中性蛋白酶-2、黏着斑激酶及迁移侵袭能力的影响

王宁 刘振华 王飞清 李克跃 潘娅

(1贵州省骨科医院药剂科，贵州 贵阳 550004；2贵州大学附属人民医院肝胆外科;3贵州中医药大学附属第一医院检验科；4贵州医科大学生理教研室)

不同转移能力肝癌细胞系中钙激活中性蛋白酶(Calpain)-2表达具有差异，与肝癌细胞的侵袭迁移能力呈正相关〔1～4〕；黏着斑激酶(FAK)在细胞增殖、存活、迁移和侵袭等诸多细胞事件中发挥重要作用〔5，6〕，FAK表达和活性升高与肝细胞癌(HCC)转移及预后不良关系密切〔7〕。川芎嗪(TMP)具有钙离子拮抗作用〔8，9〕，然而在肝癌细胞中的作用机制仍未彻底阐明，本文就TMP对人肝癌细胞Calpain-2、FAK及迁移侵袭能力的影响进行研究，以了解其抑制肝癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 MHCC97-H肝癌细胞系由中国科学院上海生命科学院细胞库提供，盐酸TMP注射液(北京四环科宝制药有限公司，批号14032015)用DMEM培养液溶解为1.0 mg/ml质量浓度〔10〕，使用0.22 μm直径的滤器进行除菌过滤备用。兔抗FAK(Y570)抗体：美国Bioworld Technology公司，羊抗Calpain-2(C-19)抗体购于Santa Cruz公司。

1.2MHCC97-H细胞培养 采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培养基(高糖)进行细胞培养；置于 37℃含5%CO2的孵育箱中进行培养，每隔2 d更换培养基1次，待细胞生长融合达 80%左右进行后续的实验处理。

1.3划痕实验 待MHCC97-H细胞生长至90%时，1×105个/ml/孔细胞接种于24孔板，待24 h后细胞融合85%，用20 μl加样枪头进行划痕，减血清培养基饥饿处理4 h后加入TMP(1.0 mg/ml)培养细胞24 h。0 h、24 h测量划痕宽度计算细胞迁移率。

1.4侵袭实验 使用基质胶在Transwell小室上层铺成单层，放入37℃细胞培养恒温孵育箱中孵育40 min。消化贴壁细胞后制备细胞悬液，分为对照组和TMP组，其中TMP组细胞予以TMP处理24 h，其余条件相同，每个Transwell小室孔接种1×105个细胞，置于24孔板中并加含10%FBS 的DMEM培养基。棉签擦去小室内层的基质胶，结晶紫染色，测穿越的细胞OD值及穿膜细胞数。

1.5Western印迹法检测蛋白水平 两组细胞培养24 h后弃陈旧的培养液，温热的三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)清洗2遍。预冷的细胞裂解液充分裂解细胞，收集细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。在高速冷冻离心机中4℃，离心20 min，转速14 000 r/min。二喹啉甲酸(BCA)方法进行样品蛋白定量，1成浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)进行样品浓度调整上样，行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，湿转法转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉进行封闭，一抗室温孵育2 h，二抗室温孵育1.5 h，漂洗后采用化学发光法进行显色，凝胶成像仪成像分析Calpain-2、FAK表达水平，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。

1.6统计处理 采用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1TMP对肝癌细胞MHCC97-H中Calpain-2、FAK蛋白表达量的影响 与对照组相比，TMP组Calpain-2、FAK蛋白表达量明显下降(P<0.05)。见表1，图1、2。

2.2TMP对肝癌细胞MHCC97-H迁移、侵袭能力的影响 与对照组比较，TMP组MHCC97-H细胞迁移率、穿膜细胞数〔(98±13)个vs(38±7)个〕及OD值明显下降(P<0.05)。见表1、图3、4。

表1 两组侵袭能力、迁移率及Calpain-2、FAK蛋白表达比较

与对照组比较：1)P<0.05

图1 Western印迹法检测两组Calpain-2蛋白表达量

图2 Western印迹法检测两组FAK蛋白表达量

图3 两组培养不同时间细胞迁移率(×100)

图4 两组穿膜细胞数(×100)

3 讨 论

近年来，原发性肝癌领域的研究进展非常迅速，对这类肿瘤的诊断和治疗取得了很大的进步〔11～13〕。目前对于肝癌的有效治疗包括肝部分切除、局部消融和肝移植，这使得5年生存率有了较大提高〔14～16〕。然而，肝移植受到供体器官短缺和器官可用性的限制，而手术切除后仍然存在术后复发率高，肝内转移等风险〔17〕。因此，寻找新的更为有效的药物及治疗方法来对抗原发性肝癌的转移，延长患者的生存是目前探索的重要方向之一。TMP是中药川芎中提取出来的有效单体，临床应用较为广泛，作用机制较为复杂，研究发现，TMP能改善糖氧剥夺海马神经元细胞内钙超载，具有钙拮抗作用，保护脑组织〔8〕。同样，郭自强等〔9〕研究发现TMP对血管紧张素Ⅱ所介导引起细胞内钙离子升高导致的心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞增殖具有抑制作用。Calpain参与细胞内多种反应，与细胞凋亡、增殖和蛋白质重整反应、细胞黏附、迁移有关，同时也是细胞迁移的一个重要信号转导体。Calpain-1和Calpain-2是Calpain的两个经典成员，不同浓度的钙离子水平是激活他们的条件。研究发现Calpain-2可以作为抑制肿瘤侵袭转移的一个潜在靶点〔18〕。FAK是一种重要的非受体蛋白酪氨酸激酶，在乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、甲状腺癌、卵巢癌和肝癌在内的多种人类肿瘤中过表达和(或)高度磷酸化〔19〕，提示该蛋白在肿瘤形成和恶性进展中可能具有潜在作用〔21〕。FAK的活性对许多与癌细胞生长和转移相关的细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化及血管生成过程中起重要作用〔20〕。Miyasaka等〔22〕发现，与癌旁非癌组织样本相比，原发性肝癌样本中FAK基因表达上调。Chen等〔23〕发现FAK的多种形式在原发性肝癌组织中过度表达，并且与肿瘤分期、血管侵入和肝内转移相关。 Calpain作用的底物较为广泛，除与整合蛋白结合外，还能作用其他黏附性蛋白。研究发现，Calpain可能通过对FAK蛋白进行剪切影响FAK激酶活性，从而改变细胞局部的黏附能力，这可能是其调控细胞迁移的机制之一〔24〕。同时，瞬时的Ca离子浓度升高可以协助FAK的磷酸化而使其活化〔25〕。FAK在整合素介导的信号传导过程中发挥中心分子作用，其活化后可通过调节一系列信号传导通路而影响细胞增殖和存活。本实验中，通过TMP处理后，MHCC97-H 中Calpain-2、FAK蛋白含量明显下调，其迁移率、穿膜细胞数及OD值明显下降，这可能与TMP发挥钙拮抗作用，抑制Calpain-2、 FAK的表达从而使得肝癌细胞系的迁移侵袭能力减弱。