骨髓间充质干细胞共培养对转化生长因子β1诱导的ARPE-19上皮间充质转化的影响

焦守峰 柴勇 杨鑫民

(1南昌大学第三附属医院，江西 南昌 330000；2江西省儿童医院；3南昌大学医学部)

年龄相关性黄斑变性(AMD) 是一种进展性、退行性疾病，发病机制尚未完全阐明，尤其是干性AMD仍没有突破性进展〔1〕。本课题组前期发现，视网膜色素上皮(RPE)细胞间充质转化(EMT)是AMD病因之一，因此，预防RPE细胞EMT的发生发展，可能是治疗AMD的新思路。

间充质干细胞(MSCs)是一种多能干细胞，存在于各组织中，并可转化为多种组织细胞〔2〕。MSCs是一种重要的免疫调节细胞，具有逆转不同背景的肝纤维化作用〔3〕。我们推测在AMD发病早期，移植MSCs可通过改善EMT机制来改善AMD病变。目前关于MSCs用于AMD治疗的研究较少。本研究拟探讨MSCs在实验性AMD中调控EMT的作用及机制，以期为临床运用MSCs治疗AMD开拓新思路和提供理论依据。

1 材料和方法

1.1主要材料 人RPE细胞素ARPE-19细胞购自美国ATCC公司；达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM/F-12)购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；重组人转化生长因子(TGF)β1购自美国Peprotech公司；α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体、闭锁连接蛋白(ZO)-1抗体、Vimentin抗体、E-cadherin抗体及β-actin抗体均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；CO2细胞培养箱购自日本SANYO公司，实时定量PCR仪与蛋白免疫印迹设备购自美国BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 ARPE-19细胞与骨髓MSCs用含10%胎牛血清的DMEM/F-12常规培养。当细胞生长融合度达约90%时，将细胞分为正常组(CON组)、TGFβ1组及MSCs共培养组(MSCs组)。正常组细胞常规培养；TGFβ1组加入5 ng/ml的重组人TGFβ1诱导细胞EMT；MSCs组在MSCs与ARPE-19细胞于Transwell共培养的基础上给予TGFβ1诱导EMT。

1.2.2细胞共培养 培养第3代MSCs与ARPE-19至对数期，用胰酶消化重悬计数，按1×106个/孔接种MSCs于Transwell共培养系统下室，将Transwell的上室置于孔中，接种ARPE-19细胞，使上下室的培养液相互通融，从而建立起MSCs与ARPE-19的共培养体系，培养72 h终止培养并分析。

1.2.3CCK8法检测细胞增殖能力 取对数期常规培养及与MSCs共培养的ARPE-19细胞悬液接种于96孔板，每孔总体积100 μl，每孔加入10 μl的CCK8试剂，恒温箱孵育1.5 h后用酶联免疫检测仪测定450 nm条件下的OD 值。

1.2.4免疫蛋白印迹 提取细胞蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳后蛋白质通过电转化转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭120 min；封闭结束后4℃下使用一抗孵育过夜，然后用羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG二抗孵育，最后用显影仪显示结果。

1.2.5荧光定量PCR检测mRNA水平变化 提取各组总RNA，使用紫外分光光度仪测出每个样品RNA浓度；参照逆转录试剂盒进行逆转录，收集cDNA进行荧光定量PCR检测。

1.2.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测基质金属蛋白酶(MMP)-9和MMP抑制因子(TIMP)-1水平变化 收集各组细胞培养液，根据MMP-9和TIMP-1检测试剂盒步骤对其进行检测，通过检测450 nm波长条件下的OD值，测定MMP-9和TIMP-1水平。

1.3统计学分析 利用SPSS22.0软件，计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组ARPE-19细胞增殖能力比较 与CON组〔(99.76±8.53)%〕相比，TGF-β1组ARPE-19细胞的增殖活性显著降低〔(72.15±12.35)%；P<0.05〕；而MSCs组ARPE-19细胞增殖能力显著高于TGF-β1组〔(84.63±14.71)%，P<0.05〕。

2.2各组ARPE-19细胞EMT水平变化 通过检测相关指标的蛋白水平了解各组细胞EMT发生情况。结果显示，TGFβ1预处理可显著增加ARPE-19细胞内α-SMA与Vimentin的表达，并显著降低ZO-1和E-cadherin的表达(均P<0.05)，提示TGFβ1诱导ARPE-19细胞发生显著EMT；而MSCs共培养能有效降低细胞内α-SMA与Vimentin的表达，并显著升高ZO-1和E-cadherin的表达水平(均P<0.05)，提示MSCs共培养能改善细胞EMT水平。见表1，图1。

表1 各组EMT指标蛋白水平比较

与CON组比较：1)P<0.05；与TGFβ1组比较：2)P<0.05；下表同

图1 各组ARPE-19细胞 EMT相关指标的蛋白水平

2.3各组ARPE-19细胞EMT相关指标的基因水平比较 各组ARPE-19 细胞EMT相关指标的基因表达水平变化与蛋白表达水平变化趋势一致：TGFβ1预处理可显著增加ARPE-19细胞内α-SMA与Vimentin mRNA的表达，并显著降低ZO-1和E-cadherin mRNA表达(P<0.05)；而MSCs共培养可显著逆转TGFβ1引起的α-SMA与Vimentin mRNA增高及ZO-1和E-cadherin mRNA水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组EMT指标mRNA表达水平比较

2.4各组ARPE-19细胞MMP-9和TIMP-1水平比较 ARPE-19细胞经TGFβ1刺激后MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平显著增加，与CON组比较均具有显著差异(P<0.05)；MSCs组能逆转TGFβ1刺激效应，显著降低MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平(P<0.05)。见表3。

表3 各组MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平比较

3 讨 论

AMD已经成为中国老年人群中低视力和致盲的主要原因〔4〕。目前已知，RPE细胞的结构完整对AMD的发生至关重要，而EMT的发生对RPE的完整性有重要影响〔5,6〕。因此，如何抑制RPE细胞EMT的发展，可能是预防AMD的新思路。

TGFβ1是一类能够介导EMT发生的多肽类细胞因子，能够识别并结合细胞膜表面的受体，调控基因转录〔7,8〕。本实验结果显示，TGFβ1能引起细胞增殖能力下降；从蛋白及mRNA水平分析EMT水平发现，TGFβ1刺激能显著诱导ARPE-19细胞EMT的发生。同时，TGFβ1刺激ARPE-19细胞后可导致细胞中MMP-9及TIMP-1生成增多，破坏MMP-9/TIMP-1平衡，由此推测TGFβ1可能通过促进细胞外基质降解，参与EMT的发生。

MSCs是一种具有分化能力的多能干细胞，活化后对免疫系统有很强的调节作用〔9〕，在角膜烧伤、干燥症等疾病中的治疗效果已被证实。Park等〔10〕向泪腺注射人MSCs后，萎缩的泪腺结构渐趋正常；Acar等〔11〕用MSCs进行滴眼治疗眼干燥症模型也取得理想效果。Kasashima等〔12〕用GFP标记的MSCs注射至钩针损伤的成年大鼠视网膜下腔，发现MSCs发生迁移整合。以上研究都提示MSCs移植对于视网膜损伤等疾病的治疗发挥了积极的作用。本实验利用MSCs与ARPE-19共培养，能抑制TGFβ1刺激引起的细胞增殖活性降低；且能从蛋白及mRNA水平抑制细胞内TGFβ1刺激引起的α-SMA与Vimentin增高，并降低ZO-1和E-cadherin表达水平，提示MSCs共培养能改善细胞EMT水平。此外，MSCs共培养能有效逆转TGFβ1刺激效应，显著降低MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1水平，这可能是MSCs共培养抑制EMT发生的一种机制。