解毒通络调肝方对2型糖尿病大鼠肝脏组织IRE1相关蛋白表达的影响

孙哲宇 朴春丽 米佳 姜晓天 唐程 王丽

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2广州中医药大学深圳医院(福田)；3长春中医药大学附属医院内分泌科)

近年来，内质网应激(ERS)引起2型糖尿病(T2DM)发生发展已受到医学界广泛关注〔1～3〕。相关研究认为，ERS通过肌醇依赖酶(IRE)1激活相关通路诱导胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞凋亡〔4～6〕。解毒通络调肝方是朴春丽教授临床治疗T2DM的常用有效方剂，课题组前期相关实验证实，本方可通过多靶点、多条通路改善IR及保护胰岛β细胞功能〔7～9〕。本研究采用解毒通络调肝方干预T2DM大鼠模型，观察肝脏组织ERS相关因子IRE1α及其磷酸化蛋白的表达，进一步探讨本方改善IR及保护胰岛β细胞的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择SPF级9周龄健康、雄性的ZDF大鼠88只和ZL大鼠10只(购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK京2014-0003)。饲养于环境温度(24±1)℃，湿度为55%±5%的洁净动物房(北京文慧净化设备厂)内，每日光照黑暗12 h/12 h循环，所有大鼠均自由饮用普通自来水。采用高脂颗粒饲料Purina #5008(购自上海介宏贸易有限公司)饲养ZDF大鼠，维持普通饲料#1022(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)饲养ZL大鼠。

1.2实验主要试剂 一抗：IRE1-抗IRE1抗体、p-IRE1-抗IRE1(phospho S724)抗体及二抗羊抗兔IgG均购自Abcam 公司；二抗磷酸二氢钠购自西陇化工厂，磷酸氢二钠、柠檬酸、甲醇、30%过氧化氢均购自北京化工厂；山羊血清购自中杉金桥，Triton购自Sigma；二辛尼可酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天研究有限公司，化学发光液购自北京普利莱生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1造模、分组及给药 以随机血糖≥11.1 mmol/L作为T2DM成模标准，动态观察88只ZDF大鼠随机血糖及体重变化〔10〕。实验进行至第13周时，成功制备ZDF大鼠T2DM模型59只，并将成模的ZDF大鼠按体重和血糖水平分层，随机分为模型组15只、西药组11只、中药低、中、高剂量组各11只，空白对照组为ZL大鼠10只。第13周给予各组大鼠为期4 w的灌胃治疗。解毒通络调肝方(中药来源：长春中医药大学附属医院制剂室，4℃冰箱保存)由榛花、大黄、黄连、双花、黄芪、丹参、柴胡构成，灌胃前根据所含原药材量计算，中药低、中、高剂量组分别用相应剂量蒸馏水稀释，灌胃剂量分别为1、3、5 g/(kg·d)；西药组用阳性对照药盐酸二甲双胍片，购自天津太平洋制药有限公司(国药准字：批号 080313)，灌胃前将其完全溶解后用蒸馏水稀释，灌胃剂量为0.5 g/(kg·d)；模型组与空白对照组使用等体积蒸馏水每天灌胃1次。

1.3.2标本采集 各组大鼠灌胃治疗第17周，乙醚麻醉，快速提取肝脏组织，迅速放入液氨保存，用于Western印迹检测IRE1α及磷酸化(p)-IRE1α蛋白的表达水平。

1.3.3检测方法 分别将IRE1α、p-IRE1α一抗浓度参照1∶325、1∶90稀释；二抗浓度参照1∶1 000稀释。具体步骤：取肝组织约50 mg，在冰冻缓冲液中研碎，加入去污剂蛋白裂解液(含苯甲基磺酰氟) 400 μl进行总蛋白的提取，用BCA蛋白浓度试剂盒测定样本蛋白的浓度，取含蛋白40 μg的溶液体积为上样量，加入样品处理液，煮沸7～10 min，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)120 min后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下用5%脱脂奶粉(脱脂奶粉+TBST缓冲液) 封闭1.5 h；洗膜后依次加一抗及二抗孵育、漂洗；将普利莱化学发光液A液和B液约1 ml充分混匀后铺于膜正面，室温1～3 min后，去除膜表面的残液，置于曝光盒中曝光、显影、定影。用Quantity One软件扫描各条带的吸光度(A值)并分析结果，GAPDH作为内参照进行半定量分析。

1.4统计学处理 应用SPSS20.0软件行非参数检验。

2 结 果

各组肝脏IRE1α、p-IRE1α蛋白的表达水平，各组大鼠肝脏组织内均有IRE1α、p-IRE1α蛋白表达，与空白对照组相比，其余各组肝脏IRE1α、p-IRE1α蛋白表达均显著上调(P<0.01)。与模型组比较，各药物组肝脏组织IRE1α、p-IRE1α蛋白表达水平均有不同程度下降，且各药物组中，中药高剂量组下调最为明显(P<0.01)。IRE1α蛋白的表达水平以中药高、中、低剂量组下降最显著(P<0.01)，西药组IRE1α蛋白表达水平虽有下降，但与模型组相比无明显意义(P>0.05)。与模型组相比，西药组、中药中、高剂量组p-IRE1α蛋白表达水平均明显下调(P<0.01)，中药高剂量组p-IRE1α蛋白表达与其他治疗组比较下调最为明显(P<0.01)，西药组下降水平与中药中剂量组相当(P>0.05)，中药低剂量组表达虽有减少，但与模型组比较无明显意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1 各组大鼠肝脏组织IRE1α、p-IRE1α蛋白表达(OD值，

与空白对照组相比:1)P<0.01，与模型组相比:2)P<0.01；与西药组相比:3)P<0.01，4)P<0.05

1.空白对照组；2.模型组；3.西药组；4.中药低剂量组；5.中药中剂量组；6.中药高剂量组图1 各组肝脏组织IRE1α、p-IRE1α蛋白的表达

3 讨 论

内质网(ER)是相关蛋白合成的细胞位点，在蛋白质合成、折叠和转运，钙离子稳态和脂质合成中起着重要作用。钙离子稳态失衡、缺氧、高糖应激等刺激可干扰ER中蛋白质的折叠过程，导致ERS并引发未折叠的蛋白质反应。短时间的ERS可以促进蛋白质有效折叠及细胞自身保护，但持续的ERS则触发相关通路引发IR和细胞凋亡。ERS与IR和胰岛β细胞凋亡紧密相关，受到医学界的广泛关注，缓解ERS可能是治疗T2DM的一个新靶点〔1～3〕。

IRE1是内质网膜上的感应蛋白之一，IRE1α作为其异构体广泛存在于哺乳动物的细胞中，正常情况下与ER伴侣分子结合免疫球蛋白(BiP)/葡萄糖调节蛋白(GRP)78紧密结合，而在ERS的情况下，BiP/GRP78 和IRE1α解离释放。具有激酶活性的IRE1α自身磷酸化形成p-IRE1α，具有核酸内切酶活性的IRE1α则剪切X盒结合蛋白(XBP)1 mRNA生成具有转录活性的XBP1s，调控相关基因促进细胞存活〔11〕；但持续的ERS时，IRE1α-XBP-1通路可直接引起IR；p-IRE1α则通过介导c-jun N端激酶(JNK)和IκB激酶(IKK)通路进一步使胰岛素受体底物(IRS)-1丝氨酸磷酸化，抑制胰岛素受体信号传导，同时上调炎症因子的表达，出现组织内的炎症反应，促使ERS引起IR〔4〕；此外，IRE1α通过激酶的作用招募肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2与凋亡信号调节激酶(ASK1)结合成复合物IRE-TRAF2-ASK1，该复合物可激活JNK通路介导细胞凋亡途径〔5〕；亦有研究证明，IRE1α可不依赖于JNK途径而直接介导BH3交叉域死亡受体激动剂(Bid)激活B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)和其同系拮抗因子(Bak)，从而启动线粒体凋亡途径〔6〕。

解毒通络调肝方由榛花、大黄、黄连、双花、黄芪、丹参、柴胡组成，是朴春丽教授总结多年临床经验所组，也因此创立了解毒通络调肝之根本大法。全方重在解毒，活血化瘀、疏经通络亦有侧重，清热、祛湿、化浊兼顾，扶正祛邪贯穿始终，随症加减立足于根本。肝失疏泄、升降失司乃本病之因，因此产生的痰、湿、浊、瘀、热等日久胶结谓之“毒邪”，此乃本病之态，“毒损肝络”乃本病核心病机，因此用解毒通络调肝之法则直中病靶，激活机体排毒能力，攻补兼施、扶正祛邪，通畅络脉，推陈出新，谓之“正本以求源”。

本研究结果显示，ZDF 大鼠经Purina #5008高脂饲养诱导形成的T2DM动物模型存在ERS；经解毒通络调肝方干预后，IRE1α、p-IRE1α蛋白表达水平均下调，其中，高剂量组下调最为明显。综上所述，本方可能通过调节IRE1介导的相关信号通路缓解ERS、改善IR和保护胰岛β细胞，并再次验证了“毒损肝络”乃T2DM的病理基础，解毒通络调肝为其治疗大法，至于IRE1介导的具体相关信号通路有待后续进一步实验验证。