IL-23/IL-17炎症轴与冠心病及动脉粥样硬化的关系

黄珊 杨洋 孟庆雯 左琦

(海南医学院第一附属医院心血管内科，海南 海口 570102)

冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉发生动脉粥样硬化(AS)而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，又称为冠心病(CHD)〔1〕。AS斑块主要由浸润的炎症细胞(如巨噬细胞，T细胞，树突细胞等)介导形成，因此炎症反应被认为是CHD及其他AS并发症的重要机制〔2〕。白细胞介素(IL)-23/IL-17炎症轴是介导炎症级联反应的重要信号轴，在AS与CHD的发生发展过程中起到重要调控作用〔3，4〕。其中，炎症因子IL-23可促进Th17细胞的生存与分化，同时Th17细胞又可通过肿瘤坏死因子(TNF)炎症通路、细胞核转录因子(NF)-κB通路等分泌IL-17，从而引起炎症反应〔5〕。另外，IL-23可能通过影响巨噬细胞源性泡沫细胞促进AS的发生和发展〔6〕。但IL-23/IL-17调控CHD发展的具体作用机制还未见报道。本研究拟进一步探讨IL-23/IL-17炎症轴与CHD及AS之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1～11月在海南医学院第一附属医院行冠状动脉造影的患者56例，排除患有自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、肝肾功能不全者。将36例诊断为冠心病的患者分别纳入稳定性心绞痛组(18例)和不稳定性心绞痛(18例)，另外对照组20例。稳定性心绞痛组中男10例，女8例，年龄31～64〔平均(53±1.56)〕岁；不稳定性心绞痛组中男9例，女9例，年龄35～68〔平均(57 ± 2.38)〕岁；对照组中男11例，女9例，年龄37～64〔平均(55 ± 2.68)〕岁。3组一般资料无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已得到伦理委员会批准，且均已签署知情同意书。

1.2实验试剂 人单核细胞系THP-1购自北京协和细胞资源中心。RPMI1640培养液和胎牛血清购自英国Abcam公司。佛波酯(PMA)购自北京百灵威生物科技有限公司。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)购自北京索莱宝科技有限公司。IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6和TNF-α试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α一抗和实验所用二抗均购自英国Abcam公司。

1.3细胞培养 人单核细胞系THP-1用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液在5% CO2的细胞培养箱中培养，温度为37℃。每2 d换一次培养液，3～4 d传代一次。细胞计数后参照文献〔7〕方法，用含100 ng/ml PMA的培养液调整细胞浓度，以2.5×104个/ml的浓度接种于96孔板上。培养72 h后，THP-1经PMA诱导分化为巨噬细胞，随机分为两组，去除含PMA的原培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，分别加入ox-LDL培养液，对照组加入0 mg/ml的ox-LDL，诱导组加入50 mg/ml的ox-LDL处理，培养24 h后观测细胞形态并进行检测。

1.4酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症因子的表达 采取受试者外周血5 ml，离心(3 500 r/min，15 min)后取血清，保存于-20℃待测。IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度均使用ELISA试剂盒检测，严格按照试剂盒说明书操作。

ox-LDL培养液培养24 h后，收集对照组与诱导组的细胞培养液，1 000 r/min离心5 min，收集上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测IL-23、IL-17的浓度。

1.5Western印迹检测蛋白表达 ox-LDL培养液培养24 h后，吸取培养液用PBS洗涤2次，用RIPA裂解液进行裂解处理，置于冰上每10 min震荡一次，共4次，用BCA法进行蛋白定量。蛋白调至相同浓度后加入5×蛋白上样缓冲液，95℃变性5 min，以1 500 r/min低速离心后以待上样。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶室温封闭2 h，分别加入NF-κB P65一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶1 000)、IL-1β一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶500)、IL-6一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶1 000)和IL-6一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶500)于4℃孵育过夜。第二天用Tris-HCl缓冲盐溶液加吐温20(TBST)洗涤3次，每次5 min。加入二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤5次，每次8 min。抗体封闭洗脱完毕后，对PVDF膜进行显影。使用FCE型凝胶化学发光成像仪拍照，Image J软件进行灰度分析。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1炎症因子浓度在血清中的变化 稳定性心绞痛组和不稳定性心绞痛组血清中IL-23与IL-17浓度均明显高于对照组，且不稳定性心绞痛组IL-23与IL-17浓度最高(P<0.01，P<0.001)。同时，与对照组比较，稳定性心绞痛组和不稳定性心绞痛组血清IL-1β、IL-6和TNF-α浓度均明显升高(P<0.01，P<0.001)，且不稳定性心绞痛组IL-1β、IL-6、TNF-α浓度高于稳定性心绞痛组(P<0.05)。见表1，表2。

2.2IL-17和IL-23在泡沫细胞中的表达 对照组细胞为THP-1细胞分化的巨噬细胞，呈圆形或椭圆形贴壁生长；诱导组细胞，经油红O染色，显微镜下可见细胞质内有大量红色脂质颗粒沉积，符合泡沫细胞的形态学特征，见图1。与对照组相比，诱导组中IL-17与IL-23浓度显著升高(P<0.01，表3)。

表1 3组血清IL-17和IL-23浓度比较

与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.001

表2 3组血清IL-1β、IL-6和TNF-α浓度比较

与对照组比较：1)P<0.01,2)P<0.001；与稳定性心绞痛组比较：3)P<0.05，下表同

图1 ox-LDL诱导的THP-1细胞形态变化(油红O染色，×200)

组别IL-17IL-23对照组412.0±54.2345±41.3诱导组734±67.11)687±87.51)

2.3NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α在泡沫细胞中的表达 诱导组THP-1细胞NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α表达均明显高于对照组(P<0.01，图2，表4)，表明NF-κB P65信号通路参与了CHD患者炎症反应的调控。

图2 Western印迹检测细胞中NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达

组别NF-κB P65 IL-1βIL-6TNF-α对照组0.12±0.040.10±0.020.20±0.020.11±0.05诱导组0.84±0.061)0.92±0.071)0.95±0.081)0.89±0.071)

3 讨 论

CHD是一种AS引起的慢性炎症性疾病，其发病机制与动脉脂代谢紊乱、遗传因素和免疫反应异常有关，发病过程中巨噬细胞可分化形成泡沫细胞，从而分泌出大量炎症介质诱导炎症反应的发生〔8～10〕。大量研究表明，炎症系统异常与CHD患者预后密切相关，是导致CHD患者心绞痛不稳定的主要因素〔11〕。IL-23/IL-17炎症轴在CHD等炎症性疾病的发病过程中起关键作用，可通过激活巨噬细胞进而诱导中性粒细胞聚集加重病情并产生不良预后〔12〕。因此，探究IL-23/IL-17在CHD中的作用及作用机制可能有利于寻找CHD治疗的潜力药物。本实验结果表明，IL-23/IL-17炎症轴的激活引起了相应炎症因子浓度升高，并可能导致CHD患者不稳定性心绞痛。

巨噬细胞是血管炎症的中心载体，在AS的发病机制中扮演重要角色〔13〕。细胞ox-LDL水平与CHD患者体内M1巨噬细胞的分化有直接关系，ox-LDL可诱导巨噬细胞分化为泡沫细胞，从而诱导炎症因子的产生，诱发AS〔14〕。本实验用PMA诱导THP-1细胞系分化后与ox-LDL共同孵育，诱导泡沫细胞形成，经形态学观察表明细胞模型构建成功。进一步研究发现，泡沫细胞IL-23和IL-17的浓度与正常巨噬细胞比较明显升高，同时，泡沫细胞中NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白呈高表达状态，进一步表明IL-23/IL-17炎症轴参与了CHD及AS的发生发展。

研究表明，NF-κB 信号通路的激活是冠状动脉微栓塞炎症反应的主要发病机制〔15〕。通过上游因子的活化可促使NF-κB激活，进一步促进TNF-α及其他促炎因子的释放，最终影响冠状动脉微栓塞引发的心脏功能障碍的发生和发展〔16〕。IL-23在脂多糖(LPS)的刺激或异常的炎症条件下，可使NF-κB信号通路激活，刺激CD4+T细胞分化为Th17，使Th17分泌促炎症因子IL-1、IL-6、IL-17、IL-22和TNF-α，表明NF-κB信号通路参与IL-23/IL-17炎症轴的活化，进一步引起炎症反应〔17,18〕。同时，NF-κB信号通路与IL-23/IL-17炎症轴的共同作用使IL-1β与TNF-α在巨噬泡沫细胞中聚集并发生炎症反应，提示二者共同作用参与了CHD及相关疾病的病程发展〔19〕。本文研究结果提示IL-23/IL-17炎症轴诱导CHD患者炎症反应可能与激活NF-κB炎症信号通路有关。

综上所述，IL-23/IL-17炎症轴的活化与CHD患者的炎症反应密切相关，可能是导致不稳定性心绞痛的原因，并且作用机制可能与NF-κB信号通路的激活有关。