用瑞利光散射技术测定猪肉中卡马西平残留

2019-04-25庞向东吴小燕何树华

分析科学学报 2019年2期

江虹, 庞向东, 李娜, 吴小燕，何树华

(长江师范学院化学化工学院，长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100)

卡马西平是一种常见的抗惊厥、抗癫癎及抗神经性疼痛的精神性药物，属二苯并氮杂类抗癫痫药。该药对治疗精神运动性发作效果最好，对大发作、局限性发作和混合型发作也有较好作用，还可用于三叉神经痛、舌咽神经痛、心律失常及尿崩等症的治疗。它的副作用主要有：头晕、嗜睡、乏力、恶心、呕吐、皮疹等；若用药过量，会引起剧烈眩晕、嗜睡、呼吸不规则、颤抖、异常心跳加快等，尤其是老年性心血管患者，只要稍过量，就会诱致窦性心动过缓或完全性心脏阻滞。我国农业部在176号公告中规定，严禁在动物饲料和饮用水中添加镇静、抗惊厥药物，在动物源性食品中也不得检出此类药物。在畜牧业中，为了使畜禽快速增长，喂养过程中，有的喂养者会擅自在饮水或饲料中加入镇静药物如卡马西平等，快速催肥畜禽动物，达到增收目的，致使在动物源性食品中残留该类药物，从而对消费者身体健康造成一定危害。由此可见，研究动物源性食品(如猪肉)中残留卡马西平具有重要意义。

目前国内外检测卡马西平的方法主要有高效液相色谱法[1 - 6]、荧光法[7]、分光光度法[8]、电化学法[9 - 11]和液-质联用[12 - 13]等，未见用瑞利光散射(RLS)技术进行猪肉中残留卡马西平的研究。实验发现，在弱酸性和溴代十六烷基吡啶存在下，用胭脂红作探针测定卡马西平的RLS技术有很高的灵敏度和高选择性，分析成本低，适于猪肉中卡马西平药物残留分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光分光光度计(日本，日立公司)；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

胭脂红(分析纯，天津市光复精细化工研究所)溶液：1.0×10-4mol/L。溴代十六烷基吡啶(99%，武汉易泰科技有限公司上海分公司)溶液：称取适量溴代十六烷基吡啶(CPB)，用少量无水乙醇溶解，加水配成5.00×102mg/L。卡马西平对照品(99.7%，批号：100142-201105，中国食品药品检定研究院)溶液：精密称取卡马西平对照品适量，用少量甲醇溶解，定量转移至100 mL容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀，配制成浓度为236.3 mg/L贮备液，冰箱4 ℃保存；操作液：2.363 mg/L。Tris-HCl溶液：配成pH=3.0～9.5的系列溶液,用pH计测定。水为二次蒸馏水。

样品：不同卖家猪肉(1#～3#)，市售。

1.2 样品处理

取不同的新鲜猪肉样品(1#～3#)，分别洗净、切块并搅成肉末。精密称取肉末各15 g左右(精确至0.0001 g)于小烧杯中，加约10 mL甲醇搅匀并超声提取约40 min，再转移至离心管中，以4 000 r/min离心20 min，分出上清液后，重复提取一次，合并上清液，加甲醇约20 mL，再超声提取20 min，以4 000 r/min离心20 min，使蛋白质变性沉淀，上清液转入小烧杯中，于100 ℃水浴浓缩至约3 mL，即为待测样液(各平行处理5份)。

1.3 实验方法

于10 mL刻度比色管中，依次准确加入适量卡马西平标准溶液，3.50 mL 1.0×10-4mol/L胭脂红溶液、0.50 mL 5.0×102mg/L溴代十六烷基吡啶溶液及2.50 mL Tris-HCl溶液(pH=6.55)，用二次蒸馏水定容。5 min后，在荧光仪上设λex=λem=220 nm，测定狭缝5.0 nm，同步扫描上述溶液，得RLS光谱。于371 nm波长处测定体系溶液及试剂空白溶液的瑞利光散射强度IRLS及I0，计算ΔIRLS=IRLS-I0。

2 结果与讨论

2.1 瑞利散射光谱

图1 不同体系的瑞利散射(RLS)光谱Fig.1 RLS spectra of different systems1.0.236 mg/L carbamazepine;2.3.50×10-5 mol/L cochineal carmine;3.25.0 mg/L cetylpyridinium bromide(CPB);4.3.50×10-5 mol/L cochineal carmine,pH=6.55;5.25.0 mg/L CPB,pH=6.55;6.0.236 mg/L carbamazepine-3.50×10-5 mol/L cochineal carmine,pH=6.55;7-12.0.0,0.0473,0.0945,0.142,0.189,0.236 mg/L carbamazepine-3.50×10-5 mol/L cochineal carmine-25.0 mg/L CPB,pH=6.55.

图1分别为卡马西平溶液、胭脂红溶液、溴代十六烷基吡啶溶液及反应产物溶液的RLS光谱。结果表明，(1)单独的卡马西平、胭脂红及溴代十六烷基吡啶溶液的RLS均很微弱；(2)胭脂红及溴代十六烷基吡啶的弱酸性溶液的RLS也很微弱；(3)当卡马西平与胭脂红同时存在于弱酸性溶液中时，它们之间虽可发生反应(卡马西平接受质子后以阳离子形式存在于溶液中，胭脂红是一种酸性染料，以阴离子形式存在于溶液中)，但生成物的RLS仍很微弱；(4)当溴代十六烷基吡啶与胭脂红共存于弱酸性溶液中时(溴代十六烷基吡啶是一种阳离子表面活性剂，在溶液中以阳离子形式存在)，溴代十六烷基吡啶对胭脂红具有增敏作用，使RLS显著增强，并产生具有双峰的新RLS光谱；(5)当卡马西平、胭脂红及溴代十六烷基吡啶同时存在于弱酸性溶液中时，胭脂红既可与卡马西平以静电引力相结合，也可与溴代十六烷基吡啶以静电引力相作用，无论它们以哪种方式相结合，最终生成三元离子缔合物，摩尔质量增大，使RLS增强；(6)一定浓度范围的卡马西平的质量浓度与体系的RLS增强强度ΔIRLS呈线性关系。故该方法可用于卡马西平的定量分析。

2.2 反应条件

2.2.1反应酸度及用量对反应适宜酸度的考察结果表明，所建立体系适宜pH范围为4.5～8.5(图2)，此范围内体系的ΔIRLS最大且较稳定，实验选用pH=6.55的Tris-HCl溶液。当其用量为2.50 mL时，体系ΔIRLS相对最大，灵敏度最高。

2.2.2胭脂红溶液的浓度对胭脂红适宜浓度的考察结果表明，室温条件下，胭脂红溶液浓度为3.5×10-5mol/L时，体系的ΔIRLS相对最大(图3)。当胭脂红溶液的浓度大于或小于3.5×10-5mol/L，因胭脂红自身的聚集作用使体系ΔIRLS减弱。故实验选用3.50 mL 1.0×10-4mol/L胭脂红溶液。

2.2.3溴代十六烷基吡啶溶液的浓度对反应中使用何种增敏剂来提高反应的灵敏度进行了考察，结果表明，室温下，使用十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、OP乳化剂、Triton X-100、Tween-20、溴化十六烷基三甲基铵等均不能使反应的RLS增强，但用溴代十六烷基吡啶(CPB)则可明显增强体系的RLS信号，故实验用溴代十六烷基吡啶作反应的增敏剂。当反应中溴代十六烷基吡啶溶液的浓度为25.0 mg/L时，体系ΔIRLS最大(图4所示)，方法灵敏度最高。故实验用0.50 mL 5.00×102mg/L溴代十六烷基吡啶溶液。

图2 缓冲液pH值对ΔIRLS的影响Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

图3 胭脂红溶液浓度对ΔIRLS的影响Fig.3 Effect of cochineal carmine concentration on ΔIRLS

图4 CPB溶液浓度对ΔIRLS的影响Fig.4 Effect of CPB concentration on ΔIRLS

2.2.4试剂加入顺序对三元反应中试剂加入顺序的考察结果表明，室温下，试剂的最佳加入顺序为：卡马西平、胭脂红、溴代十六烷基吡啶、Tris-HCl，按此顺序加入各试剂，体系的ΔIRLS较大，灵敏度较高。

2.2.5反应速度及稳定性对反应速度的考察结果表明，室温下5 min内，反应可以进行完全,且ΔIRLS达最大值，稳定时间至少1 h。故实验选在5 min后进行测定。

2.3 RLS强度与卡马西平的浓度关系

按最佳实验条件配制卡马西平标准系列溶液，并扫描体系的RLS光谱。由卡马西平的ΔIRLS-c工作曲线可知，卡马西平的质量浓度在0.0060～0.24 mg/L范围内与体系的ΔIRLS呈线性关系，回归方程为:ΔIRLS=-21.62+3871c(mg/L)，相关系数r=0.9985，方法的检出限为0.0060 mg/L，定量限为0.013 mg/kg。

2.4 方法的选择性

2.5 样品分析

取1.2节中处理后的不同新鲜猪肉待测液各5份，按实验方法测定猪肉中卡马西平的含量。测定结果表明，在最佳测定波长371 nm处，均未检出卡马西平。为了考察本方法的准确度和精密度，分别进行不同加标浓度的回收试验，各做5份平行测定，根据回归方程求得各回收试验中卡马西平的平均值，再计算回收率和相对标准偏差，实验结果见表1。