基于分子印迹技术检测鸡肉中16种喹诺酮药物残留

王 瑞， 徐 军， 张瑞良， 王文静， 王 磊, 赵 霞， 杨艳菲， 李 琳*

(安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

喹诺酮类药物(QNs)是于20世纪60年代出现的一类人工合成抗菌药，主要通过抑制细菌DNA复制而发挥抗菌作用，具有抗菌谱广、抗菌作用强、口服吸收好、使用方便、价格低廉等优点，被广泛应用于畜禽和水产养殖业。随着QNs在临床上的不合理或过量使用，易引起潜在的致癌、致畸、致突变作用，其在环境中的残留问题也越来越显著[1 - 3]。基于环境与消费者安全考虑，欧盟、美国食品药物管理局和中国农业部[4 - 6]等都制定了QNs在动物源性食品中的最高残留限量(MRL)。因此，加强对QNs的残留监测，建立快速、灵敏、可靠的定量检测方法非常必要。

鸡肉样品基质复杂，低浓度的目标物易被干扰，导致提取和净化不彻底，因此对样品前处理技术要求较高。固相萃取[7 - 8]是常用的样品前处理方法。传统固相萃取的目标物与吸附剂之间是非特异性的，填料选择性不强，常发生与杂质共萃取的现象，影响后续分析[9 - 10]。而分子印迹固相萃取(MISPE)是以高选择性的分子印迹聚合物(MIPs)为固相萃取填料，MIPs具有选择性地分离复杂样品中的痕量分析物、有效去除杂质干扰、提高分析的准确度和灵敏度、稳定性好、能够重复使用等优点[11 - 13]。Tang等[14]采用MISPE技术，以恩诺沙星为模板合成中空的MIPs，能够有效去除复杂基质干扰，灵敏度高。Urraca等[15]建立MISPE-LC-MS/MS法仅对鸡肉中环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、单诺沙星6种QNs进行准确测定。本文选取了16种典型的喹诺酮类药物作为研究对象，通过优化MISPE条件，建立了一种基于MISPE-UPLC-MS/MS快速测定鸡肉中喹诺酮类药物残留的分析方法，可应用于实际样品的检测，为相关药物的快速检测提供重要参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC-Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱仪及固相萃取装置(美国，Waters公司)；SupelMIPTM-SPE(25 mg/3mL，美国Sigma公司)；GHP针式滤膜(0.22 μm，美国Pall公司)。

氧氟沙星(Ofloxacin，纯度99%)、诺氟沙星(Norfloxacin，纯度99%)、培氟沙星(Pefloxacin，纯度99%)、环丙沙星(Ciprofloxacin，纯度99%)、洛美沙星(Lomefloxacin，纯度97%)、恩诺沙星(Enrofluxacin，纯度99%)、达氟沙星(Danofloxacin，纯度93%)、沙拉沙星(Sarafloxacin，纯度97%)、二氟沙星(Difluoxacin，纯度98%)、吡哌酸(Pipemidic Acid，纯度99%)、麻保沙星(Marbofloxacin，纯度99%)、依诺沙星(Enoxacin，纯度99%)、氟罗沙星(Fleroxacin，纯度99%)、奥比沙星(Orbifloxacin，纯度99%)、恶喹酸(Oxolinic acid，纯度98%)、吡咯酸(Piromidic acid，纯度98%)均购自于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。尤利沙星(Ulifloxacin，纯度95%)、加替沙星(Gatifloxacin，纯度98%)均购自于加拿大Toronto Research Chemicals公司。乙酰丙嗪(Acepromazine，纯度98%)、甲苯噻嗪(Xylazine，纯度98%)、甲氧苄啶(Trimethoprim，纯度98%)、磺胺间甲氧苄啶(Sulfamamonomethoxine，纯度98%)、磺胺对甲氧嘧啶(Sulfameter，纯度98%)、泰乐菌素(Tylosin，纯度98%)、麦迪霉素(Midecamycin，纯度98%)、罗红霉素(Roxithromycin，纯度98%)、红霉素(Erythromycin，纯度98%)均购自于上海安谱实验科技股份有限公司。磺胺硝苯(Sulfanitrn，纯度98%)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，纯度98%)、吉他霉素(Stereomycin，纯度98%)、萘啶酸(Nalidixic acid，纯度98%)、氟甲喹(Flumequine，纯度98%)均购自于美国U.S.Pharmacopeia公司。甲醇、乙腈均为色谱纯(德国CNW科技公司)；甲酸为色谱纯(北京迪马科技有限公司)；乙酸、氨水为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取上述16种喹诺酮类药物的标准品，用甲醇溶解并配制质量浓度为100 μg/mL的标准储备液，于4 ℃的冰箱中冷藏保存；使用时依次用水稀释至相应质量浓度，根据需要用流动相逐级稀释，配制适当质量浓度的16种喹诺酮类混合标准工作液，且现用现配。

1.3 液相色谱条件

Acquity LC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm,美国Waters公司)；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5.0 μL；流动相0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序:0～2 min，10%B；2～3 min，10%～15%B；3～4 min，15%～55%B；4～5 min，55%～80%B；5～5.5 min，80%～10%B；5.5～7 min，10%B。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；质谱多反应监测模式(MRM)检测；毛细管电压2 700 V；离子源温度150 ℃；雾化气流量1 000 L/h；锥孔气流量50 L/h；碰撞气流量0.24 L/h；雾化室温度450 ℃。采集参数见表1。

表1 保留时间与质谱参数

(续表1)

*Quantitative ion.

1.5 样品前处理

准确称取2 g均质后的鸡肉样品，置于50 mL离心管中，加入8 mL 0.5 mol/L KH2PO4溶液，以8 000 r/min离心5 min，收集上清于50 mL离心管中，用8 mL溶液重复提取一次，合并提取液。MISPE柱经2 mL甲醇、2 mL水活化后，加入4 mL提取液，经2 mL水、2 mL乙腈、2 mL 2%乙酸乙腈、2 mL 0.1%氨水溶液淋洗，3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，在优化条件下进行净化，收集洗脱液，于40 ℃下氮气吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈(体积比9∶1)溶解残留物，过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 MISPE柱净化条件的优化

2.1.1上样液体积的选择本实验对上样液的体积进行了研究。称取2 g空白鸡肉样品，添加10 μg/L混合标准工作溶液，分别以体积为4 mL、8 mL、16 mL的提取液上样，通过UPLC-MS/MS测定各药物的回收率。当上样体积为16 mL时，各药物的回收率最低，在45.9%～85.8%之间；而当上样体积为4 mL和8 mL时，回收率在70.4%～110.5%和60.3%～110.4%，均满足药物残留检测要求。由于鸡肉样品经磷酸盐溶液提取后，样品溶液中含有一定的杂质，且随着上样体积的增加，而基质效应会对实验结果造成一定的影响，导致后续净化不彻底[16]。因此，本实验选择4 mL提取液作为上样溶液。

2.1.2淋洗和洗脱条件的选择为了保证MISPE柱的最优效果，本实验系统比较了不同比例氨水溶液、乙酸乙腈、氨化甲醇溶液对16种QNs的淋洗与洗脱特征。对MISPE进行淋洗时，2%乙酸乙腈、0.1%氨水洗脱能力较弱，对于各药物的淋洗率均低于5%；5%乙酸乙腈、0.5%氨水、2%氨化甲醇洗脱能力逐渐增强，药物的淋洗率分别为23.8%～44.4%、33.1%～53.7%、58.4%～69.1%；5%氨化甲醇洗脱能力最强，各药物的淋洗率均高于72.3%；样品流经MISPE柱后，先用水淋洗，可有效去除样品中极性较大的杂质，以降低对MS/MS检测中的基质效应。不仅要考虑淋洗液能够洗掉柱子上的杂质、干扰物及提高MISPE柱子的选择性，同时还要保证回收率的要求，所以本实验最终选择水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水为淋洗条件。

2.1.3洗脱液体积的选择本实验研究了不同体积(2～5 mL)的洗脱液对16种喹诺酮类药物回收率的影响。当洗脱液的体积由2 mL增加至3 mL时，喹诺酮类各药物的回收率均有所提高；当洗脱液体积为3 mL时，回收率为84.3%～105.9%，各药物的都能够获得较高的回收率。当洗脱液的体积由3 mL增加至5 mL时，各药物的回收率均呈下降趋势。为了达到理想的回收率，又减少洗脱溶液中的杂质量，本实验最终选择洗脱液的体积为3 mL。

2.2 MISPE柱吸附特性的测定

2.2.1MISPE柱对于不同类药物的吸附选择性分别将含有2种镇静剂(乙酰丙嗪、甲苯噻嗪)、5种磺胺类(磺胺间甲氧苄啶、磺胺硝苯、磺胺噻唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧苄啶)、5种大环内酯类(泰乐菌素、麦迪霉素、罗红霉素、红霉素、吉他霉素)及16种目标分析物的KH2PO4溶液加入MISPE柱，依次用水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水溶液对MISPE柱进行淋洗及5%氨化甲醇进行洗脱，并且收集上样液、淋洗和洗脱液，测定各药物的回收率。由表2可见，上样液经MISPE柱后，镇静剂、磺胺类、大环内酯类不能被有效保留，有20.5%～77.5%直接流出；经水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水溶液淋洗后，残留的非目标物均被淋洗下来，而目标物的回收率极低；当采用5%氨化甲醇洗脱时，仅16种QNs被洗脱，未发现非目标物。其原因可能是镇静剂、磺胺类、大环内酯类药物的化学结构与QNs药物的化学结构相差较大，不易与MIPs重模板相互作用与结合，因而在上样、淋洗过程中就直接被淋洗下来。

表2 2种镇静剂、5种磺胺和5种大环内酯类药物在上样、不同淋洗和洗脱条件下的回收率

"-"：non detection.

2.2.2MISPE柱对于QNs的吸附选择性实验研究了MISPE柱对于喹诺酮此类药物的吸附选择性。将含有16种目标分析物和4种喹诺酮类药物(氟甲喹、恶喹酸、萘啶酸、吡咯酸)的KH2PO4溶液加入MISPE柱，同上述操作。由表3可见，上样液流经MISPE柱后，所有的药物被有效的保留在MISPE柱上；4种QNs经淋洗操作后，均在乙腈处被大量的洗脱下来，且各药物的淋洗率均在80%以上，而16种目标物的回收率极低；当采用5%氨化甲醇洗脱时，仅16种QNs目标分析物被洗脱，未发现其他4种QNs。林峰等[17]报道了脱羧峰是喹诺酮分子含有羧基基团的表征，脱羧后哌嗪环断裂重排更是喹诺酮药物特有的

表3 4种喹诺酮类药物在上样、不同淋洗和洗脱条件下的回收率

"-"：non detection.

结构表征。4种喹诺酮类药物流经MISPE柱后可以被有效的保留在柱上的原因可能是它们与16种目标物的侧链上均含有羧基，其能够与MIPs上位点相结合；但经水和乙腈淋洗后，又被大量洗脱下来的原因可能为这种结合能力较弱，可以视为无特异性吸附；推测可能是由于4种喹诺酮类药物不具有哌嗪等含氮碱基活性官能团；而16种目标分析物侧链上的这种活性官能团是其与MIPs发生特异性结合位点。

2.3 MISPE净化鸡肉中QNS残留-UPLC-MS/MS检测方法的评价

采用空白基质添加标准曲线定量，真实反映样品中喹诺酮类药物的含量。用质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L的16种混合标准溶液进行定量分析，以待测物的定量离子峰面积(Y)作为纵坐标，以待测物的质量浓度(X)作为横坐标，绘制标准曲线，各药物在0.25～200 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)均>0.99。以3倍信噪比(S/N)为检出限、10倍信噪比为定量限，16种喹诺酮类药物的检出限与定量限分别为0.08 μg/kg和0.25 μg/kg。

在鸡肉样品中添加0.25、2.5、5.0 μg/kg 3个水平的标准物质，每个水平做6个平行试验，重复3次。平均回收率为88.6%～101.9%，相对标准偏差(RSD)为2.9%～10.5%。16种喹诺酮类药物的回归方程与相关系数、添加回收率与精密度见表4。

表4 鸡肉样品中16种喹诺酮类药物的回归方程与相关系数、添加回收率与精密度

(续表4)

2.4 基质效应

本研究在空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的混合标准溶液，以各药物的峰面积对质量浓度绘制标准曲线，MISPE柱富集净化的鸡肉组织中16种喹诺酮类药物，各药物的基质标准曲线与试剂标准曲线的斜率比为81.9%～108.5%。表明，样品经MISPE柱净化后，基质效应对分析结果无明显影响。

2.5 实际样品测定

本研究建立的方法对安徽省某屠宰场采集的80份鸡肉样品进行检测。结果表明，有3份鸡肉样品中含有诺氟沙星。检测出的残留值为3.37、4.42和6.55 μg/kg。和国家标准(GB/T 20366-2006)[18]方法检测结果基本一致，且本方法选择性更好、灵敏度更高。

3 结论

建立了MISPE-UPLC-MS/MS测定鸡肉中16种QNs残留的方法，同时优化了萃取条件，使得所有药物得到了良好的分离，有效降低了基质效应，提高了方法的选择性，并且操作简单、灵敏度高。