典型品牌料酒风味物质的气相色谱/质谱指纹图谱构建及主成分分析和聚类分析

李茜云, 郭 明*,, 董颖娜, 吴荣晖

(1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州 311300； 2.浙江农林大学理学院，浙江杭州 311300)

料酒主要由黄酒基酒和香辛料组成。随着人们生活水平的提高和食品行业的快速发展，料酒市场快速发展，市场上的调味料酒种类越来越多元化[1]。生产料酒主要是酿造方法和配制方法，市场上的料酒良莠不齐，虽有行业标准(SB/T 10416-2007)规范，但由于其中风味成分复杂，很难通过简单的感官评定和一般分析来判定风味成分的质量是否达标。目前国内已有一些料酒鉴定新技术，如陈燕清等[2]利用小波变换-可见-近红外技术来鉴别品牌料酒；李英等[3]采用电子舌、色度仪和高效液相色谱对料酒的品质进行评价。这些技术方法对料酒的品牌鉴别和品质评价具有重要的参考价值。

指纹图谱技术能全面表征药材内在的化学成分种类和数量，被广泛应用于中草药等复杂成分的鉴定及质量评价。料酒为类似于中药的复杂体系，既有黄酒醇、酯、醛类等成分[4]，又有香辛料中酚类、萜类等复杂成分[5,6]。应用指纹图谱技术可以全面反映料酒中的化学成分，提供丰富的鉴别信息，可有效对料酒的真实属性及品质进行评价[7]，具有综合、宏观、模糊的非线性特点[8 - 10]，但是基于实验样本量小、实验条件和实验设计有待优化等条件限制，需要通过模式识别分析数据来验证指纹图谱构建的可行性，结合化学计量学完善指纹图谱体系以保证料酒的质量品质[11]。主成分分析和聚类分析为指纹图研究中常见的两种化学模式识别的方法，能以量化的形式对指纹图谱的数据进行多维综合的统计分析并实现样本归类，减少单个指标带来样本差异[12]。主成分分析[13]通过降维减少特征变量消除信息重叠，以较少互不相关的正交变量来表征料酒的多维信息[14]，但是考虑到主成分分析仅对贡献率较大的成分进行统计分析，可能会存在信息缺失的问题，因此采用聚类分析作为佐证。聚类分析[15]能根据料酒数据源的相似性对其进行分类，相对于指纹图谱和主成分分析更加简单、直观且不会造成数据缺失。本文采用GC-MS联用技术分析典型品牌料酒中醇、酯、萜等挥发性风味物质成分，解析典型品牌料酒之间的共性，建立品牌料酒的指纹图谱，并结合主成分分析和聚类分析从不同角度对料酒进行品牌分类和鉴别。所建立方法不仅适用于厂家自身产品的质量评价[16 - 17]，而且还可为市场质检提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

6890N-5975B安捷伦气/质联用仪(安捷伦科技有限公司)；MTN-2800W氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯)；KQ-250B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；1810D自动双重纯水蒸馏器(上海申生科技有限公司)。

二氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水Na2SO4(分析纯，上海虹光化工厂)。

14种典型品牌料酒样品：购置10种市售浙江某典型品牌的不同类型料酒，分别为老酒料酒(5年)、葱姜料酒Ⅰ、六年陈酿料酒、零添加料酒、蒸鱼料酒、15°料酒、原酿五香料酒、葱姜料酒Ⅱ、葱姜料酒Ⅲ、料酒，按顺序编码为1～10号，这10种料酒用于建立标准指纹图谱；购置4种市售不同批次的料酒，编码11～14，利用建立的标准指纹图谱评判这4种料酒的品质。

1.2 实验条件

1.2.1色谱条件色谱柱：Agilent HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；氦气(99.999%)为载气，恒定流速1.0 mL·min-1；进样口温度250 ℃，不分流进样，进样体积1 μL；升温程序：初始温度40 ℃，保持5 min；5 ℃·min-1升温至60 ℃，保持2 min；4 ℃·min-1升温至160 ℃，保持2 min；再以5 ℃·min-1升温至250 ℃，保持3 min。

1.2.2质谱条件电子轰击离子源(EI)，离子源温度230 ℃，电离能量70 eV，全扫描模式采集数据，扫描范围为40～500 amu。

1.2.3样品处理取10 mL料酒试样于50 mL具塞玻璃管，加入二氯甲烷25 mL，超声萃取20 min，经分液漏斗得料酒有机相，重复提取两次后合并。4 ℃条件下经氮气吹扫浓缩到5 mL后，加入无水Na2SO4，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3 数据分析

1.3.1共有峰的选择将10种典型品牌的料酒导入到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》中，设置S1为参照峰，根据各个成分相对保留时间的一致性进行峰匹配，以多点校正消除各图谱的时间误差，自动匹配后得到共有峰，并以平均数法生成对照指纹图谱。

1.3.2相似度评价将生成的对照指纹图谱与典型品牌料酒的内在共有峰进行相似性计算，以判断料酒质量的稳定性和差异性。其中，夹角余弦法和相关系数法的计算如公式(1)和(2)所示。

(1)

式中：q为夹角余弦值；xKj、xLj为样品K、L的第j个变量数据，j取1，2，…，p；p为变量数。

(2)

1.3.3化学计量学的数据分析基于14种料酒的492个所有色谱峰面积的样本数据：运用SPSS 19.0统计软件进行主成分降维，得到相关矩阵的方差贡献率以及主成分的得分；运用SPSS 19.0进行系统聚类，以得到其树状图。运用Origin 9.0对主成分得分作三维散点图。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

将样品按1.2.3项下方法处理后，连续进样5次。以保留时间为18.859 min的峰作为参照峰，计算得到共有峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)<0.54%，相对峰面积的RSD<2.7%，表明检测系统的进样精密度良好；将样品按1.2.3项下方法处理后，分别在0、4、12、18、24 h依次进行检测。以保留时间为18.859 min的峰作为参照峰，计算得到共有峰相对保留时间的RSD<0.18%，相对峰面积的RSD<2.3%，表明样品溶液在24 h内稳定；将样品按1.2.3项下方法处理5份，进样5次。以保留时间为18.859 min的峰作为参照峰，计算得到共有峰相对保留时间的RSD<0.15%，相对峰面积的RSD<0.2%，表明其重复性试验较好。

2.2 10种典型品牌料酒指纹图谱的建立

将10种某典型品牌料酒按1.2.3项下方法处理后，Origin软件中1～10号10种典型品牌料酒的总离子流色谱图如图1所示。由图1可知，在59 min内，总出峰300多个，色谱峰较多，各个峰得到很好的分离，峰面积较大，峰形较好。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统共提取确定29个共有峰，经NIST 08 标准质谱图库检索以及人工图谱解析(匹配度≤80%)，再结合相关文献，对各组分进行鉴定，确定影响此料酒的风味成分为醇、酯、醛、酚、烷、有机酸等化合物。鉴定的典型品牌料酒共有峰的详细信息如表1所示。

图1 10种典型品牌料酒总离子流(TIC)色谱图 Fig.1 TIC chromatograms of 10 kinds of cooking wine of typical brand The serial number(1-29)of 29 common peaks are the same as those table 1.

表1 典型品牌料酒指纹图谱共有峰组分分析结果

(续表1)

由表1可知，典型品牌料酒的29个共有峰的成分有醇类6种，酯类10种，脂肪酸2种，醛类2种，酰胺3种，酚类物质2种，酮类物质1种，杂烷物质2种，萜类物质1种。除黄酒的特征风味成分苯乙醇外，含量较高的有十二醛二甲缩醛(1.46%～6.941%)、琥珀酸单乙酯(1.77%～11.19%)、D-焦谷氨酸叔丁酯(0.60%～8.14%)和棕榈酸(2.26%～4.68%)。典型品牌料酒主要挥发性风味成分是黄酒基酒发酵过程中有机酸与醇类物质通过酵母酯化酶酯化作用生成的酯类物质[18]和醛类物质。棕榈酸来自酿造过程中谷氨酸等氨基酸成分发酵产酸期生产的细胞膜脂肪酸[19]或是典型品牌料酒中添加的八角、丁香等香辛料的成分[20]。典型品牌料酒中检测到的单萜烯物质除冰片(龙脑)、α-松油醇外，还有桉叶油素、γ-萜品醇等，γ-萜品醇为姜的主要成分[21]；月桂、花椒、姜等多种香料中均含有桉叶油素[22-24]。

2.3 指纹图谱特征峰的相对保留时间和相对峰面积

比较共有峰，选定峰面积较大的(共有峰占总峰面积大于0.5%)13个共有峰作为指纹图谱特征峰，苯乙醇作参照峰，将其保留时间和峰面积设定为1.0，计算其它特征峰的相对保留时间和相对峰面积。10种典型品牌料酒特征峰的相对保留时间和相对峰面积如表2所示。

表2 10种典型品牌料酒指纹图谱特征峰的相对保留时间和相对峰面积

Note:S1～S10 are the GC-MS fingerprint of 10 kinds of cooking wine of typical brand；R is the standard fingerprint；(*)is the relative peak area,which is different from the relative retention time.

2.4 10种典型品牌料酒指纹图谱相似度分析

10种典型品牌料酒指纹图谱相似度分析，计算结果如表3所示。

表3 10种典型品牌料酒GC-MS指纹图谱相似度计算结果

由表3可知，典型品牌料酒10个样品的相关系数法和向量余弦夹角法的数值均≤0.9400，说明该品牌不同种类的料酒具有较好的相似性，表明这10种料酒的风味成分一致性较好，技术指标稳定，能综合、准确地反映典型品牌料酒的风味情况。可以作为判定该典型品牌料酒的标准。

2.5 典型品牌料酒标准指纹图谱的品牌鉴别

为了验证指纹图谱的合理性和应用性。将4种未知品牌的料酒按1.2.3方法处理后，得到的谱图和数据同标准指纹图谱的峰形和特征峰的相似度数据比对，判定4种不详厂家和品牌的料酒品牌和质量盲评。结果如图2所示。由图2可知，从峰的总数与峰面积可看出，13号样品的峰面积和峰的数目与标准样品比较相似，11、12和14号样品的峰的数目与峰面积与标准指纹图谱存在一定差异。

图2 4种料酒与标准指纹图谱的色谱图对比 Fig.2 Comparison of chromatograms of 4 kinds of cooking wine with standard fingerprint The serial number(1-29)of 29 common peaks are the same as those table 1.

图3 前三个主成分的3D得分图Fig.3 3D scores of the first three principal components

对标准指纹图谱与4种料酒的特征峰采用夹角余弦法和相关系数法进行计算，13号样品的夹角余弦和相关系数为0.9947和0.9911，高于阈值0.9400，证实为该品牌的料酒。11号样品的夹角余弦和相关系数仅为0.5504和0.0123，12号样品的夹角余弦和相关系数为0.4843和0.2017，14号样品的夹角余弦和相关系数为0.4093和-0.0549，3个检测样品均远远低于阈值0.9400，鉴别不是该典型品牌的料酒。这与指纹图谱的判定结果完全相符。

2.6 14种料酒主成分分析的品牌鉴别和分类

将14种料酒通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的匹配数据后，按照保留时间将样品所有峰面积列出，没有的色谱峰的峰面积为0，共得到492个所有色谱峰的相对峰面积。运用SPSS 19.0以所有色谱峰面积为变量进行主成分总体分析，通过降维[25]来弱化变量间自相关性引起的误差从而得到互不相关的主成分的特征值、贡献率、累计贡献率[26]以及得分，从而实现对料酒品质的综合评价。降维得到的前3个主成分(累积贡献率53.43%)的得分在三维空间的投影情况如图3所示。

图3可将这14种料酒分为2类，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13为一类，11、12、14为另一类。即主成分分析和指纹图谱的检测结果一致。

图4 14种料酒聚类分析谱系图Fig.4 Cluster analysis spectrum map of 14 kinds of cooking wine

2.7 14种料酒聚类分析的品牌鉴别和分类

以492个所有峰的相对峰面积为变量，运用SPSS 19.0软件以余弦距离为度量标准，采用组间连接的方法对14个样品进行聚类分析，再次对料酒进行品牌验证。其结果如图4所示。从图4谱系图可见，14种料酒在类间间距D=12.5时，14种料酒大致可以分为4类。第一类为3、7、8、1、4、2、10、9、5、6、13，第二类为11，第三类为12，第四类为14。以上结果验证了指纹图谱相似度的计算结果和主成分的计算结果，即10种典型品牌料酒和13为相同品牌，其他三种料酒不属该品牌料酒。由此也验证了指纹图谱和主成分分析的合理性。

3 结论

采用品牌料酒标准指纹图谱共有峰成分来确定料酒的风味物质，计算特征峰组的相似度均达到了0.9400以上，说明标准指纹图谱的色谱图和数据可以作为典型品牌料酒的质量分析与鉴别的依据。中药色谱指纹图谱相似度评价系统能够分析影响料酒的风味成分，主成分分析和聚类分析可以对品牌进行鉴定和分类，且主成分分析和聚类分析即使在共有峰很少或没有共有峰的情况下，仍可以判别酒的真伪并分类。3种方法相互印证、相互补充，使品牌鉴别和质量评价更加可靠、更加全面、更加科学。