不明原因智力障碍与癫痫伴智力障碍患儿的基因拷贝数变异比较研究

马 楠,刘 亮,赵斯钰,王 燕,李东景,徐晓科,汪 东

(西安市儿童医院神经内科,西安 710003;*通讯作者,E-mail:wangdong6928@163.com)

智力障碍/精神发育迟缓(mental retardation/developmental delay,MR/DD)是发病在18岁以前的儿童常见的致残性疾病,发病率为2% -3%,主要特征为智力商数(IQ≤70)低下和社会适应能力明显障碍[1]。有大量研究显示,智力障碍患者基因组存在拷贝数变异(copy number variations,CNVs)异常[2]。近年来,有研究报道,高分辨单核苷酸多态性微阵列技术(array-based single nucleotide polymorphisms,aSNP)可提高15%-20%的认知障碍性疾病、先天性多发畸形、孤独症样症候群患儿的病因检出率[3]。然而,aSNP技术对智力障碍患儿CNVs异常检测报道不一致,可能存在不同类型的智力障碍患儿分子遗传基础差异,aSNP技术对不同类型的智力障碍患儿的敏感性不一致。本研究旨在探讨微阵列分析技术在不同类型智力障碍疾病检测中的应用价值,以便为该类型患者临床早期筛查提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究经西安市儿童医院伦理委员会批准,选择本院2015-06～2017-12间98例不明原因智力障碍患儿(U-MR)和90例癫痫伴智力障碍患儿(E-MR),由本院本科室中级职称医师操作,并进行回顾性研究。U-MR患者入组标准:①韦克斯勒智力量表(Wechsler intelligence scale for children,WISC)测评IQ分在70分以下;②患者排除围产期感染、创伤、窒息、药物中毒、营养不良等外界因素;③患者外周血染色体核型分析结果正常;④排除已明确的癫痫综合征、脆性X综合征、Rett综合征、脊髓性肌萎缩症(SMA)及假肥大型肌营养不良症(DMD)等已知遗传病;⑤年龄10-17岁,所有患儿均自幼即发现智力及运动发育较同龄儿落后,不伴有发育畸形患儿。体表畸形包括头围异常、眼距宽、通贯掌、腭弓高、耳异常、鼻异常等;其他先天畸形包括心脏、肾脏及中枢神经系统畸形等。

E-MR患者入组标准:①临床症状和脑电图表现确诊为儿童癫痫患者;其中包含46例全面性发作,44例局灶性发作;90例中包含10例全面性癫痫持续状态,16例局灶性癫痫持续状态。②IQ分<70分;③年龄10-17岁,发病时间1-6年。两组患儿性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 检测基因组拷贝数变异

经患儿家属同意后,采集患者及其父母外周血各5 ml,EDTA抗凝,用于制备染色体和细胞悬液以及基因组DNA的抽提。采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根公司)说明书操作提取DNA。全基因组拷贝数变异检测使用的是Affymetrix公司的CytoScan HD芯片系统平台,其含有超过270万种探针,包括75万种可以分型的SNP探针,195万个拷贝数探针。

1.3 数据分析

所得数据经正常人群数据库DGV数据库(http://projects.tcag.ca/variation/)、异常表型数据库(http://decipher.sanger.ac.uk/)、在线孟德尔遗传性疾病数据库OMIM(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)以及PUBMED进行人工筛查、检索比较分析是否有已知致病性CNVs,对致病性或可疑致病性CNVs则行FISH检测,并对父母进行检测做来源分析。据临床分析,CNVs分三类:已确定导致遗传病的致病CNVs(已知微缺失综合征或微重复综合征),潜在致病性CNVs(可能存在致病性CNVs,但尚不明确),对临床意义不明的患儿CNVs,行父母外周血样本aSNP检测,并判断患儿CNVs是遗传自父母还是新发。

2 结果

2.1 不明原因智力障碍患儿拷贝数变异分析结果

98例U-MR患儿中检出10例CNVs(见表1),男6例CNVs,女4例CNVs,检出率为10.2%;其中微缺失5例,微重复3例,其比例为5 ∶3。10例CNVs分别涉及7,11,15,16,18和X号染色体,其中15号染色体15q11.2(1例)、15q25.2(1例)和16号染色体16p11.2(2例)、16p13.11(2例)是主要发生异常改变的区域。CNVs包括5类:已知致病的微缺失/微重复综合征1例,明确致病的微缺失/微重复(非综合征)4例,染色体数目异常1例,临床意义不明4例。10例CNVs中,3例微缺失/微重复片段<5 Mb,最小检出缺失片段0.6 Mb。检出已知致病性CNVs患儿中临床表现除智力落后外,多伴矮小。检出的4例临床意义不明的CNVs中,2例为杂合性缺失(loss of heterozygotes,LOH),其区域不包含印记基因(见表1)。

2.2 癫痫伴智力障碍患儿拷贝数异常分析结果

90例E-MR患儿中检出3例CNVs(见表1),男1例CNVs,女2例CNVs,检出率为3.33% ;其中染色体数目异常2例,临床意义不明1例。3例CNVs分别涉及17,21和X号染色体。此外,与U-MR患儿中检出率(10.2% )比较,E-MR患儿检出率更低,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不明原因智力障碍10例拷贝数异常患儿临床表现及实验室结果

3 讨论

本研究首次利用aSNP技术对98例不明原因智力障碍(U-MR)和90例癫痫伴智力障碍(E-MR)患儿进行CNVs检测,在U-MR中检测出10例CNVs,总检测率10.2% ;在E-MR中检测出3例CNVs,总检测率3.33% 。本研究结果说明aSNP技术可能对不明原因智力障碍患儿检测更敏感,其检测率与Wu等[4]研究结果(5.1% )相比略有提高。可能是因为本研究对智力障碍患儿进行亚型的分类,更有利于CNVs的检测,进一步说明aSNP技术在检测CNVs时可能具有特异性,且提示U-MR患儿可能存在分子遗传基础病理机制,而E-MR是一类神经系统病变导致异常疾病。

本研究结果显示,98例U-MR患儿中检出10例CNVs中5例为微缺失CNVs,3例为微重复CNVs,其比例为5 ∶3。与Cooper等[5]报道有轻微差异,他们的结果显示缺失型是微重复的2倍,可能原因是本研究样本小(98例),Cooper等[5]研究属于15 767例的大样本研究能更加真实地显示样本分布。本研究组将进一步扩大样本探讨U-MR患儿的CNVs。

本研究结果显示,U-MR患儿主要以15号染色体15q11.2、15q25.2和16号染色体16p11.2、16p13.2为主要发生异常改变的区域,与国外研究报道一致[6-8]。Stefansson等[9]研究显示,15q11.2染色体的基因断点BP1-BP2的缺失可能与患儿严重的生长发育延迟、行为问题有关,并且损害患儿的认知功能。也有研究报道,15q11.2(BP1-BP2)缺失会降低后扣带回和岛叶的灰质体积,导致双边颞叶白质减少和胼胝体增加,且呈现与拷贝数变异数量相关[9]。可能是因为BP1-BP2间的染色体片段涉及4个基因:TUBGCP5、NIPA1、NIPA2和CYFIP1,后面3个基因广泛在神经系统表达,TUBGCP5基因在下丘脑核团表达。这些BP1-BP2微缺失均可能会导致运动、语言发育延迟[8]。大量研究也已经报道,染色体15q25.2拷贝数变异可能是小儿神经精神疾病、生长发育延迟的一个高风险基因,影响其认知功能发育[5,10]。此外,也有研究报道,16p11.2(SH2B1)、16p13.2拷贝数变异联系了精神分裂症患者和生长发育延迟[11,12]。16p13.11区域基因拷贝数变异在智力障碍患者中发生率达1‰[9]。因此,本研究结果提示15号染色体15q11.2、15q25.2和16号染色体16p11.2、16p13.2的拷贝数变异可能作为临床早期筛查患儿智力障碍的靶基因。

有趣的是本研究发现,90例E-MR患儿中检出3例CNVs,检出率为3.3% ,且显著低于U-MR的检出率(10.2% )。说明E-MR与U-MR的发病机制不同,即E-MR不是分子遗传基础病理机制的疾病,而是一类神经系统病变导致异常疾病,aSNP技术对E-MR筛查作用较U-MR小。提示不同的病因,临床上U-MR和E-MR患儿应制定不同的治疗方案。

本研究存在一定缺陷,本研究观察例数仍相对较少,需要进一步扩大研究样本,以便证实基因拷贝数变异的临床价值。此外,虽然目前微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)或者aSNP,相比于传统染色体核型分析而言,对认知障碍性疾病、先天性多发畸形、孤独症样症候群患儿的病因检出率有所提高[3],但是采用aSNP和aCGH技术对U-MR患儿检出率报道仍不一致[13-15],将来研究需进一步证实aSNP在U-MR患儿早期筛查中的临床价值。