PPARγ/NF-κB信号通路参与替米沙坦抑制血管紧张素……诱导的大鼠心肌纤维化及改善心功能作用

李博涛,项 羽,崔倩卫,王军奎,赵 娜*

(1西省人民医院心内一科,西安 710068;2西安医学院附属陕西省人民医院心内科;*通讯作者,E-mail:dr.zhaona@qq.com)

心脏纤维化是心脏重塑的重要病理过程之一,同时也是促进心肌舒张及收缩功能减弱,导致心力衰竭的心血管终末病理生理状态发生的重要原因之一[1]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin aldosteron system,RAAS)调节失衡是导致心力衰竭发生发展的重要病理生理过程之一。大量研究显示RAAS系统过度激活能促进以胶原成分为主的细胞外基质聚积于心脏间质,最终发生心脏纤维化[2]。因此,抑制RAAS系统过度激活是抑制细胞外基质沉积,从而预防和治疗心力衰竭的关键过程之一。迄今为止,大量临床研究证据明确RAAS系统抑制剂—血管紧张素酶转换剂及血管紧张素-2受体阻滞剂能发挥抑制心脏纤维化作用[3]。

替米沙坦是一种新型长效高选择性血管紧张素2受体1型阻滞剂,目前在临床中被广泛应用于高血压病的治疗。除此之外,一部分临床试验证实替米沙坦具有不依赖于其降压效应的心脏保护作用[4],如能抑制高血压诱导心脏重塑[5],扩张型心肌病心脏重塑[6]及心肌梗死心脏重塑[7]中的胶原沉积,发挥抗纤维化作用。

替米沙坦抗心脏纤维化作用的具体分子机制多种多样,多数与其阻断血管紧张素受体相关,然而目前少量研究也已表明存在替米沙坦发挥抑制纤维化作用不依赖于血管紧张素受体的证据[8]。本课题组前期研究发现替米沙坦不直接以TGF-β1/Smad信号通路为靶点在RAAS系统过度激活作用下发挥抗心脏纤维化作用[9],本研究旨在进一步探讨替米沙坦发挥抑制RAAS系统激活下的心脏纤维化的具体机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理

将40只4周龄雄性SD大鼠(SPF级,西安交通大学动物实验中心),体质量(112.44 ± 7.62)g,随机分为四组,每组10只,分别为对照组(Vehicle/Veh)、血管紧张素……组(Ang ……)、血管紧张素……+替米沙坦组(Ang ……+Telm)和替米沙坦组(Telm)。采用外科手术方式为大鼠皮下植入Alzet渗透压缓释泵(Durect公司,美国)[10],每天泵入生理盐水(Veh),或0.8 mg/kg Ang ……,持续4周分别制作对照组及心肌纤维化模型组(Ang ……)。利用天狼猩红染色评价心肌纤维化模型是否成功。造模成功后,在Ang ……组基础上采用灌胃法使用替米沙坦溶液处理大鼠,剂量为10 mg/(kg · d),灌胃液体积2.5 ml/100 g,共连续处理2周制作血管紧张素……+替米沙坦组(Ang ……+Telm)。在对照组基础上采用灌胃方法处理替米沙坦,剂量为10 mg/(kg · d),灌胃液体积2.5 ml/100 g建立替米沙坦组(Telm)。

1.2 心脏超声检测

采用Vevo770 ultrasound system(Visual Sonics Inc,加拿大)小动物超声仪对大鼠心脏结构和功能进行无创性评价(探头频率17.5 MHz,探测深度2 cm,扫描速度100 mm/s)。超声探头置于大鼠胸骨前,二维超声清晰显示左室短轴切面,于乳头肌水平应用M型超声记录左心室运动曲线,测量舒张末期左室内径(left ventricular end-diastolic inner-dimension,LVIDd)、收缩末期左室内径(left ventricular end-systolic inner-dimension,LVIDs),计算左室短轴缩短率(fraction shortening,FS)。FS%=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%。

1.3 血流动力学检测

采用颈动脉心室内插管法评估各组大鼠心脏血流动力学指标。10%水合氯醛腹腔注射对大鼠进行麻醉,解剖右侧颈外动脉,插管后连接压力换能器采集生物信号,启动生物信息采集系统(AD Instrument)生物压力检测模块,检测左室收缩压(LVSP)以及左室舒张末压(LVEDP)。

1.4 天狼猩红染色评价胶原沉积

分离部分心室肌组织,置于4%多聚甲醛后,经进一步脱水,石蜡包埋后,进行天狼猩红染色(Leagene公司)观察心脏间质纤维化。胶原组织呈现天狼猩红色,纤维化面积占总心室肌面积采用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0处理计算。

1.5 蛋白质免疫印迹法评估大鼠心肌组织PPARγ/NF-κB信号通路活化情况

处死大鼠后收集心室肌标本,RIPA裂解液(Santa Cruz公司)匀浆、离心后获得心室肌组织总蛋白。心肌组织细胞核蛋白提取按照细胞核蛋白提取试剂盒说明进行操作(ThermoFish公司)。称取25 mg心肌组织,剪碎后,加入胞质提取试剂Ⅰ 250 L后匀浆,将匀浆转入EP管中,涡旋震荡15 s后,冰孵10 min;随后加入13.75 L胞质提取试剂……,涡旋震荡5 s后冰孵1 min。再次涡旋震荡5 s后,16 000g离心5 min,将上清转移另一预冷EP管。进一步涡旋上清中未完全溶解部分,加入100 L冰细胞核提取试剂,涡旋震荡3次,每次15 s,冰上静置10 min,随后16 000g离心10 min,取上清液即获得细胞核蛋白。蛋白浓度定量采用BCA蛋白定量法。总蛋白或核蛋白样品应用100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶分离,转移至硝酸纤维素膜,在50 g/L脱脂牛奶中封闭1 h,总蛋白样品分别加入PPARγ(Santa Cruz公司)、NF-κB(Abcam公司)、GAPDH(Abcam公司);核蛋白样品分别加入NF-κB(Abcam公司)及Lamin B(BOSTER公司)抗体,分别在4 ℃下孵育12 h。PBST洗涤后进行洗膜,室温下,采用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h。采用化学发光法使条带显影,显影图像利用吸光度法定量,GAPDH及Lamin B蛋白水平用作内参校正蛋白。

1.6 细胞培养及免疫荧光共聚焦显微镜

参考文献[11]方法分离培养乳大鼠心脏成纤维细胞,待细胞融合至80%,更换无血清培养基,24 h后,给予血管紧张素……(0.1 mol)处理预孵育1 h,或与替米沙坦(10 nmol)共孵育24 h。随后去除上清液,在4%多聚甲醛中固定15 min,由含有0.5%的Triton X-100 PBS渗透化处理15 min。洗涤封闭后,与NF-κB抗体孵育3 h。洗涤后,与FITC标记的二抗室温下孵育60 min。应用Hoechst 33342复染细胞核。应用共聚焦激光扫描显微镜(Olympus FV1000)获取图像。

1.7 统计学分析

实验数据均采用SPSS 16.0进行统计学分析,数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 替米沙坦处理对心肌纤维化大鼠心功能的影响

与Veh组相比,Ang ……组大鼠FS显著下降(P<0.05);与Ang ……组大鼠相比,Ang ……+Telm组大鼠FS显著增加(P<0.05,见图1)。与Veh组相比,Ang ……组大鼠LVSP显著降低(P<0.05),同时LVEDP水平显著升高(P<0.05);与Ang ……大鼠相比,Ang ……+Telm大鼠LVSP显著增加(P<0.05),LVEDP显著下降(P<0.05,见图1)。

Veh:对照;Ang ……:血管紧张素 ……;Telm:替米沙坦;FS:短轴缩短率;LVEDP:左室舒张末压力;LVSP:左室收缩压;与Veh组相比,*P<0.05;与Ang ……组相比,#P<0.05图1 各组大鼠心脏超声短轴缩短率及心脏血流动力学指标比较Figure 1 Comparison of fraction shortening level captured by M-mode echocardiography and hemodynamic indexes among four groups

2.2 替米沙坦处理对心肌纤维化大鼠胶原的影响

心脏组织天狼猩红染色所示,与Veh组相比,Ang ……组心脏组织中胶原水平显著增加(P<0.05);与Ang ……组相比,Ang ……+Telm组心脏组织内胶原水平显著减少(P<0.05,见图2)。

2.3 替米沙坦处理对PPAR-γ/NF-κB信号通路的影响

与Veh组相比,Ang ……组大鼠心肌组织全细胞PPAR-γ蛋白表达降低,NF-κB蛋白表达不变,细胞核NF-κB蛋白表达增加(P<0.05);与Ang ……组相比,Ang ……+Telm组大鼠心脏组织全细胞PPAR-γ蛋白表达增加,NF-κB蛋白表达不变,细胞核NF-κB蛋白表达降低(P<0.05,见图3)。

在心脏成纤维细胞中,与Veh组相比,Ang ……组NF-κB活化入核,而Ang ……+Telm组NF-κB入核被抑制(见图4)。

Veh:对照;Ang ……:血管紧张素 ……;Telm:替米沙坦;CVF:胶原容积比例图2 各组心肌组织胶原蛋白天狼猩红染色Figure 2 Sirius red staining of collagen content in four groups

Veh:对照;Ang ……:血管紧张素 ……;Telm:替米沙坦;与Veh相比,*P<0.05;与Ang ……组相比,#P<0.05图3 各组大鼠心肌组织内PPARγ/NF-κB信号通路激活情况Figure 3 The expression of PPARγ/NF-κB signal pathway in four groups

3 讨论

心脏纤维化是各种各样的心脏疾病,如高血压、心肌梗死、心肌病等共同病理终点,也是导致心脏衰竭的重要原因。心脏纤维化表现为成纤维细胞(fibroblasts)增殖、分化为肌成纤维细胞(myofibroblasts),肌成纤维细胞合成及分泌大量胶原蛋白,导致心肌顺应性下降,僵硬度增强,最终发展为心脏舒张及收缩功能受损[12]。

图4 各组心脏成纤维细胞中NF-κB活化入核比较Figure 4 The activated NF-κB in nucleis by immunofluorescence

肾素-血管紧张素……-醛固酮系统活化在心肌纤维化中扮演重要角色。血管紧张素……活化后通过内皮素[13,14]、TGF-β-Smad信号通路[15]、PPARγ信号通路[16]、SP1信号通路[17]等多途径激活心脏纤维化。近期研究显示替米沙坦能上调PPARγ表达[18],改善胰岛素抵抗。而NF-κB是PPARγ下游的重要信号分子,受到PPARγ的失活调控[19,20]。NF-κB家族包括5个成员:p65,p50,p52,RelB,c-Rel,通常以二聚体形式存在,其中p50/p65在生物体内分布最广泛,含量最高,生物活性也最高[21]。NF-κB异二聚体p50/p65解聚后,p65在各种因素调控下活化,活化后进入细胞核,对下游基因发挥正向转录调节作用[21]。既往研究证实NF-κB P65活化后,能促进细胞外基质沉积[22],胶原组织的增加[19]。同时,PPARγ失活NF-κB p65发挥抗纤维化作用在肝纤维化[23]、肺纤维化[24]等病理过程中已被证实。而PPARγ/NF-κB信号通路是否参与血管紧张素……诱导的心肌纤维化尚不清楚。此外,替米沙坦是否通过PPARγ/NF-κB信号通路参与抑制心肌纤维化亦无明确证据证实。

本研究首先采用血管紧张素……诱导建立心脏功能不全和心肌纤维化模型,提示心肌纤维化过程参与心脏功能下降。随后本研究发现,血管紧张素……导致的心肌纤维化模型中,PPARγ蛋白表达水平明显降低,初步证实PPARγ诱导的信号通路参与血管紧张素……诱导大鼠心肌纤维化病理过程。此外,研究结果进一步发现血管紧张素……诱导的大鼠心肌纤维化模型中,心脏组织中NF-κB蛋白水平不变,然而细胞核NF-κB P65蛋白水平显著增高,且细胞水平进一步明确血管紧张素……促进NF-κB活化入核,而替米沙坦能抑制上述过程,证实PPARγ/NF-κB信号通路参与血管紧张素……诱导的大鼠心肌纤维化模型。

临床中目前针对心脏重塑的治疗也包括对肾素-血管紧张素……-醛固酮系统的抑制。替米沙坦属于血管紧张素……受体拮抗剂,其保护肾脏[25],抑制肾纤维化[26]、肝纤维化[27]的活性均已得到研究证实及临床应用。本研究明确血管紧张素……诱导心肌纤维化模型中亦发现替米沙坦能发挥抗纤维化作用及改善心功能作用。然而替米沙坦发挥抗纤维化作用究竟是通过何种机制尚未完全明确,我们前期研究发现替米沙坦在血管紧张素……诱导的心肌纤维化模型中发挥抗纤维化作用并不依赖于TGF-β/Smad信号通路[9,17]。本研究在血管紧张素……诱导大鼠心肌纤维化模型中发现替米沙坦能发挥抗心脏纤维化,改善心功能作用,同时对其可能的分子生物学机制做一初步探讨,结果发现,替米沙坦能够上调PPARγ蛋白表达,并下调细胞核NF-κB P65蛋白表达。此外,在血管紧张素诱导的心肌纤维化的细胞模型上,替米沙坦能促进NF-κB入核,亦进一步证明替米沙坦通过上调PPARγ蛋白水平,进一步使得NF-κB失活而发挥抗纤维化作用的机制。

总之,在心力衰竭的发生发展过程中,心脏纤维化在心功能的不断恶化中扮演重要的角色。本课题发现替米沙坦通过减轻心肌纤维化改善心功能,并证实PPARγ/NF-κB信号通路是其作用的分子机制之一。研究结果进一步补充完善血管紧张素……促进纤维化的发病机制,并为替米沙坦在心肌纤维化中的应用增加了一定的理论基础。