槐糖脂通过线粒体途径诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制

成利娟,杨 莉,蒋 磊,侯 梅,马晓静

(1安徽省第二人民医院药剂科,合肥 230041;2安徽中医药大学科研实验中心,新安医学教育部重点实验室;3合肥工业大学生物与医学工程学院;*通讯作者,E-mail:clj20180826@126.com)

胃癌(gastric cancer)是发生在胃黏膜上皮组织的恶性肿瘤,以胃腺癌最为常见[1],在我国各类恶性肿瘤中发病率居第二位[2],是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。

研究发现，槐糖脂主要由非致命性酵母菌产生,属于糖脂类生物表面活性剂,分为酸型和内酯型[3,4]。槐糖脂因其无毒、环保、生物可降解等优点在石油工业、农业、日化、医药行业展示出良好的前景[5-9]。内酯型槐糖脂具有很好的药物学活性,近年来,槐糖脂的抗肿瘤作用已有多篇文献报道[10-14],但内酯型槐糖脂对人胃癌SGC-7901细胞的作用尚不明确。本研究初步探讨了内酯型槐糖脂对SGC-7901细胞的作用及其可能的作用机制,为槐糖脂开发应用提供相应的依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。槐糖脂由合肥工业大学生物与医学工程学院马晓静副教授提供,纯度为99.8%。DMEM高糖培养基(货号:C11995500BT)购于Gibco BRL公司;CCK-8(货号:C008-3)购自上海七海复泰生物科技有限公司;Bax抗体(货号:ab32503)、Bcl-2抗体(货号:ab32124)、Caspase 9抗体(货号:ab2324)、Caspase 3抗体(货号:ab13847)及Cyt-c抗体(货号:ab13575)购于Abcam公司;β-actin抗体(货号:TA346894)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号:ZB-2301)及辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(货号:ZB-2305)均购于北京中杉金桥生物技术有限公司;胞浆蛋白提取试剂盒(货号:P0033)、DAPI染色液(货号:C1005)及超敏ECL化学发光试剂盒(货号:P0018)均购自江苏碧云天生物技术研究所。

高压蒸汽灭菌锅(日本Tomy KOQYO公司);艾科浦超纯水系统(重庆颐洋企业发展有限公司);CO2培养箱(MCO-175型,日本Sanyo);洁净工作台(SW-CJ-1F型,安泰);倒置显微镜(CK2型,日本Olympus);多功能酶标仪(Spectra Max M5,美国MD);电泳转印系统(Bio-Rad公司);凝胶成像系统(Protein Simple)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测槐糖脂对SGC-7901细胞活力的影响 取对数生长期SGC-7901细胞,胰酶消化,细胞悬液按照7×103个/ml密度接种于96孔板,每孔100 μl(阴性对照组加入等体积PBS),每组设6个复孔;待细胞贴壁后,未加入槐糖脂的空白对照组换用完全培养基,槐糖脂作用组则加入不同浓度的槐糖脂(40,80,160,320 μg/ml)分别作用24、48 h,在倒置显微镜下观察SGC-7901细胞形态,并与空白对照组比较细胞贴壁状态,体积,折光性、碎裂等变化,并拍照。每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,在酶标仪450 nm处检测各孔吸光度值(OD值)。按以下公式计算细胞存活率:存活率( % )=(槐糖脂作用组OD值-阴性对照组OD值)/(空白对照组OD值-阴性对照组OD值)×100%。

1.2.2 荧光染色检测细胞凋亡 将处于对数生长期的SGC-7901细胞以每孔7×103个/ml密度接种于6孔板中,每孔分别加入2 ml新鲜培养基,培养过夜。实验分为空白对照组及槐糖脂作用组,加入不同浓度的槐糖脂(40,80,160,320 μg/ml)培养24 h,弃去培养基,用4 ℃预冷的PBS洗两遍,各孔沿孔壁轻轻加入1 ml的4%多聚甲醛固定;15 min弃去多聚甲醛液,每孔加入1 ml的PBS清洗细胞,再加入DAPI染液1 ml/孔。室温条件下避光染色10 min,弃染液,用预冷的PBS轻洗一次后立即于倒置荧光显微镜下观察。

1.2.3 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位 取对数生长期SGC-7901细胞,消化收集后,以细胞悬液(7×104个/孔)接种于6孔板,2 ml/孔。实验分为空白对照组及槐糖脂作用组,加入不同浓度的槐糖脂(40,80,160 μg/ml),在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。小心吸取培养液,用胰酶消化后500g/min离心5 min收集细胞后重悬于培养基中,每管加入罗丹明123染液1 ml,充分混匀置于细胞培养箱中37 ℃避光孵育20 min,用PBS洗涤2次,用400 μl PBS重悬后于流式细胞仪检测。

1.2.4 Western blot检测Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase3及Caspase 9蛋白表达 取对数生长期SGC-7901细胞,实验分为空白对照组及槐糖脂作用组,加入不同浓度的槐糖脂(40，80，160 μg/ml)培养24 h,提取细胞总蛋白,操作如下:4 ℃预冷的PBS洗涤2次,再加入含PMSF的RIPA细胞裂解液,置于冰上孵育10 min,12 000 r/min离心10 min收集上清于EP管中,加入loading buffer后100 ℃煮10 min,置于-20 ℃保存,胞质蛋白提取采用胞质蛋白提取试剂盒,BCA法测定蛋白质浓度。使用12%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳、转膜,5% BSA溶液37 ℃封闭2 h;4 ℃下一抗(Bcl-2抗体、Bax抗体、Cyt-c抗体、Caspase3抗体及Caspase 9抗体,以上抗体的稀释度均为1 ∶2 000)孵育过夜。次日,TBST每隔10 min洗膜一次,共三次;在含有HRP标记的二抗(1 ∶40 000)室温孵育1 h,TBST洗膜。最后,配制ECL试剂,曝光,分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度槐糖脂对SGC-7901细胞活力的影响

40 μg/ml槐糖脂作用SGC-7901细胞24 h,倒置显微镜下观察细胞形态出现皱缩,体积变小,折光性明显下降,部分细胞漂浮,细胞贴壁状态差,随着作用时间的延长,细胞贴壁减少,脱落,碎裂并漂浮于培养液中(见图1)。槐糖脂处理后,人胃癌SGC-7901细胞的存活率显著降低,药物作用24 h后IC50是155 μg/ml。作用48 h后IC50是127 μg/ml。表明槐糖脂可以抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖,该抑制作用与槐糖脂浓度成正相关且具有时间依赖性(见图2)。

A.空白对照组 B.40 μg/ml槐糖脂组图1 倒置显微镜下观察SGC-7901细胞形态学变化 ( ×100)Figure 1 Cell morphology after sophorolipid treatment under inverted microscope ( ×100)

与空白对照组(0 μg/ml)比较,*P<0.05,* *P<0.01图2 不同浓度槐糖脂分别作用24 h和48 h后SGC-7901细胞存活率变化Figure 2 Survival rate of SGC-7901 after sophorolipid treatment for 24 h and 48 h

2.2 槐糖脂对SGC-7901细胞凋亡的影响

空白对照组中的细胞核质显示出微弱暗淡的蓝色,染色质荧光表达均匀;槐糖脂作用组随槐糖脂浓度增高细胞数量呈梯度减少,细胞核内染色质固缩,呈新月形发亮蓝白色,呈现明显的凋亡特征(见图3)。槐糖脂浓度梯度增加时,镜下出现蓝色致密浓染的细胞比例也随之增加(见图3)。结果表明,槐糖脂能够诱导人胃癌SGC-7901细胞发生凋亡,且诱导细胞凋亡的作用强度与槐糖脂浓度成正比。

2.3 槐糖脂对SGC-7901细胞线粒体膜电位的影响

流式细胞术检测结果分析,与空白对照组比较,槐糖脂(40,80,160 μg/ml)作用24 h后细胞荧光强度均显著降低(见图4)。定量分析,与空白对照组比较,40,80,160 μg/ml槐糖脂作用后细胞荧光强度均降低且差异具有统计学意义(见图5),提示槐糖脂作用SGC-7901细胞后造成细胞线粒体膜电位降低。

A. 空白对照组;B. 40 μg/ml槐糖脂组;C. 80 μg/ml槐糖脂组;D. 160 μg/ml槐糖脂组;E. 320 μg/ml槐糖脂组图3 DAPI染色荧光显微镜下观察槐糖脂对SGC-7901细胞凋亡的影响 ( ×200)Figure 3 Effect of sophorolipid on apoptosis of SGC-7901 observed under fluorescent microscope (DAPI,×200)

图4 Rhodamine 123染色法流式细胞术分析测定槐糖脂作用SGC-7901细胞后荧光强度变化Figure 4 Effect of sophorolipid on mitochondrial membrane potential after Rhodamine 123 staining by flow cytometry

2.4 槐糖脂对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白的影响

Western blot结果显示,与空白对照组相比,槐糖脂作用组SGC-7901细胞Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白水平显著升高(P<0.05,见图6);Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.05,见图6);槐糖脂处理后SGC-7901细胞浆中的Cyt-C蛋白水平显著升高(P<0.05),Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达明显升高(P<0.05,见图6)。

与空白对照组(0 μg/ml)比较,*P<0.05,* *P<0.01图5 不同浓度槐糖脂作用SGC-7901细胞后荧光强度变化Figure 5 Effect of different concentrations of sophorolipid on fluorescent intensity of SGC-7901

与空白对照比较,*P<0.05,* *P<0.01图6 槐糖脂对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白的影响Figure 6 Effect of sophorolipid on apoptosis of related proteins in SGC-7901

3 讨论

槐糖脂因其无毒、环保、可100%生物降解等优点受到越来越多的关注,其抗肿瘤活性在医药行业展示出良好的前景,研究发现内酯型槐糖脂对结肠癌细胞的增殖具有较好的抑制作用[15],对乳腺癌细胞也表现出较大的毒性[16],但其对胃癌的作用及作用机制仍有待阐明。

该研究显示内酯型槐糖脂作用于人胃癌SGC-7901细胞后,细胞皱缩,体积变小,折光性明显下降,部分细胞漂浮,细胞贴壁状态差,随着作用时间的延长,细胞基本脱落,细胞内容物外溢、细胞解体,细胞核出现收缩、碎裂和溶解,细胞呈凋亡样改变,细胞生存率显著下降,由此可知槐糖脂对胃癌SGC-7901细胞的增殖具有很好的抑制作用。

研究证明,细胞凋亡是由基因控制的细胞程序死亡,可通过内源性线粒体途径实现,凋亡过程中,线粒体膜的完整性被破坏[17],线粒体膜电位下降是细胞死亡早期的标志性现象。罗丹明123(Rhodamine 123)是一种广泛被用来检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Ψm)的荧光探针,实验通过该方法发现内酯型槐糖脂可以显著降低SGC-7901细胞线粒体跨膜电位,表明槐糖脂可引起SGC-7901细胞线粒体损伤,提示槐糖脂诱导人胃癌SGC-7901细胞发生程序死亡可能是通过线粒体介导的细胞凋亡途径实现的。

线粒体凋亡途径受Bcl-2家族成员的调控,包括抗凋亡的Bcl-2蛋白和促进凋亡的Bax蛋白,其中线粒体凋亡途径的关键步骤是线粒体将胞质中的细胞色素C(Cyt-C)释放至胞质中[18]。Cyt-C与细胞质中的凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease activating factor 1,Apaf-1)结合形成凋亡小体,导致Caspase-9原型活化进而激活Caspase-3[19]。Caspase-3是细胞内源性凋亡程序中最为关键的限速酶,是细胞凋亡的重要执行者[20]。Western blot结果显示槐糖脂作用细胞后,线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著下降,Bax、Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达明显升高,以上差异均具有统计学意义,表明槐糖脂可能是促进线粒体中的Cyt-c蛋白向胞质释放,进一步通过激活Caspase 3和Caspase 9诱导SGC-7901细胞发生凋亡。以上结果提示线粒体介导的细胞凋亡途径是内酯性槐糖脂诱导人胃癌SGC-7901细胞发生程序死亡的机制之一。

综上所述,研究结果表明内酯型槐糖脂可诱导SGC-7901肿瘤细胞发生凋亡,其机制可能与调低Bcl-2/Bax蛋白比值,从而引起Cyt-C的释放,进而导致Caspase 9和Caspase 3活化有关。结果提示线粒体途径可能是内酯型槐糖脂诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的途径之一,其具体机制有待进一步研究证明。