边缘前皮质α1肾上腺素受体调节帕金森病模型大鼠的焦虑样行为

吴仲恒,王 涛,惠艳娉,李立博,张巧俊*

(1西安交通大学第二附属医院康复医学科,西安 710004;2西安交通大学基础医学院生理学与病理生理学系;*通讯作者,E-mail:zhangqj@mail.xjtu.edu.cn)

边缘前皮质(prelimbic cortex,PrL)是内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)腹侧部的重要组成部分,主要参与情感、认知和记忆等功能活动的调节[1]。PrL是参与条件反射恐惧消除和焦虑行为调节的重要结构[2]。α1肾上腺素受体在与焦虑等情感行为调节相关的边缘叶脑区中有丰富表达,如mPFC、杏仁核和海马等[3]。早期研究证实,体循环给予α1肾上腺素受体激动剂可以诱导大鼠产生焦虑样反应,而α1肾上腺素受体拮抗剂则发挥抗焦虑样作用[4]。既往的研究还显示α1肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪可以阻断西酞普兰的抗焦虑作用[5]和大麻素受体拮抗剂AM251的致焦虑作用[6]。以上研究结果提示α1肾上腺素受体的激活或阻断在焦虑相关疾病中发挥重要的调节作用。

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以运动迟缓、肌强直和静止性震颤等运动系统症状为主要表现的神经系统退行性疾病,此外,还具有一系列非运动系统症状(non-motor symptoms,NMS)如焦虑、抑郁和认知障碍等。这些NMS甚至早于运动症状出现并持续存在[7]，且和健康相关生活质量下降有关[8]。PD患者中焦虑和抑郁障碍常伴发,经治疗后抑郁症状改善,但大多数情况下焦虑仍存在[9],如何治疗PD相关焦虑障碍成为近年来关注的热点。PD主要的病理改变为黑质-纹状体多巴胺(dopamine,DA)通路损害,但DA通路损害往往伴有去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)等其他神经递质系统的功能紊乱。因此,激活或阻断PrL内α1肾上腺素受体可能通过调节PrL及相关边缘脑区的神经活动影响PD焦虑样行为,而目前并未见研究探讨PrL内α1肾上腺素受体对PD焦虑障碍的调节作用及机制。本研究以6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)损毁的PD模型大鼠为对象,采用高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)实验,观察6-OHDA单侧损毁内侧前脑束(medial forebrain bundle,MFB)后对大鼠焦虑样的行为影响,观察激活或阻断PrL中α1肾上腺素受体对大鼠焦虑样的行为影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验选用健康成年雄性SD大鼠(SPF级,6-8周龄)共156只,体质量240-330 g,由西安交通大学动物实验中心提供,动物许可证号:SCXK(陕)2012-003。大鼠在标准环境下饲养,12 h昼/夜循环,室温(22 ± 2)℃,并自由饮水、摄食。实验过程最大限度减少动物用量和减轻动物的痛苦。

1.2 主要试剂与仪器

6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、阿朴吗啡(apomorphine,APO)、盐酸苯肾上腺素(phenylephrine hydrochloride,选择性α1肾上腺素受体激动剂)和盐酸苯那沙坦(benoxathian hydrochloride,选择性α1肾上腺素受体拮抗剂)等购自美国Sigma公司。6-OHDA和APO均溶解于含0.02%抗坏血酸的生理盐水中,盐酸苯肾上腺素和盐酸苯那沙坦均溶解于生理盐水中,所有药物均于实验当天配制。脑立体定位仪(SN-2N)和微电极推进器(SM-21)购自于日本Narishige公司、冰冻切片机购自于美国Thermo-Scientific公司,牙科电钻(PK-500)购自于中国台湾宝工实业股份有限公司、数码摄像机(HR-550E)购自于日本Olympus公司等。

1.3 实验分组和大鼠帕金森病模型的建立

1.3.1 实验分组 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组和PD模型组,每组78只,为进一步评测MFB损毁或PrL内注射α1肾上腺素受体激动剂或拮抗剂对大鼠行为学的影响,两组大鼠均分4个亚组进行分析(n=8-10):①生理盐水/生理盐水组:先注射生理盐水0.5 μl作为前对照,然后注射生理盐水0.5 μl作为溶媒组;②生理盐水/苯肾上腺素组:先注射生理盐水0.5 μl(溶媒)作前对照,然后注射苯肾上腺素0.5 μl(α1肾上腺素受体激动剂);③生理盐水/苯那沙坦组:先注射生理盐水0.5 μl(溶媒)作前对照,然后注射苯那沙坦0.5 μl(α1肾上腺素受体拮抗剂);④苯那沙坦/苯肾上腺素组:先注射苯那沙坦0.5 μl(α1肾上腺素受体拮抗剂)作前对照,然后注射苯肾上腺素0.5 μl(α1肾上腺素受体激动剂)。

1.3.2 大鼠帕金森病模型的建立 采用右侧MFB注射6-OHDA建立单侧完全损毁的PD大鼠模型。腹腔注射4%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠,将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。根据Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱确定右侧MFB位置(AP 4.4 mm,ML 1.2 mm,DV 7.8 mm距硬脑膜)[10]。利用牙科电钻在定位点转孔,直径约2 mm,暴露脑表面。在转孔上方固定充灌6-OHDA(12 μg/4 μl)溶液的10 μl微量注射器,注射器前端粘有玻璃微电极,利用微电极推进器缓慢进针,到达注射部位后按0.5 μl/min缓慢注射,注射完毕后留针5 min,然后缓慢退针,缝合皮肤,再次消毒手术部位皮肤。以同样方式,在假手术组大鼠仅注射4 μl生理盐水作为对照。

外科手术后1周,采用APO诱发旋转实验评估6-OHDA损毁是否成功。大鼠颈部皮下注射APO(0.05 mg/kg),药物注射后15 min内如果大鼠出现向6-OHDA损毁MFB对侧的持续旋转行为,且5 min内旋转次数大于20圈以上则判定为合格的PD模型,可用于进一步的实验[11]。

1.4 导向套管的埋置和PrL内药物注射

1.4.1 导向套管的埋置 参考Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱确定右侧PrL位置(AP 3.3 mm,ML 0.7 mm,DV 2.0 mm距硬脑膜)[10]。利用牙科电钻在PrL颅骨表面定位标记点钻直径约2 mm的小孔,暴露脑表面。用螺丝刀在定位小孔周围拧紧消毒的3-4枚小螺丝。将不锈钢套管固定在夹持器上,定位在PrL定位孔上方,利用微量推进器将套管缓慢推进至PrL上方1 mm处,然后用牙科水泥均匀涂抹固定套管和螺丝。待牙科水泥冷却凝固后,小心移除夹持器,并向不锈钢套管内插入不锈钢内芯,防止后期套管因出血、渗出或异物堵塞。大鼠在套管埋置手术完成后恢复1周。

1.4.2 PrL内药物注射 行为学检测前10 min,拔出套管内芯,首先把与1 μl微量注射器连接的PE-10导管插入预先埋置的导向套管,导管尖端达套管末端下1 mm处,然后向两组大鼠右侧PrL内分别注射以下药物:生理盐水(剂量0.5 μl)、盐酸苯肾上腺素(剂量0.5 μl,浓度20 g/L)和盐酸苯那沙坦(剂量0.5 μl,浓度10 g/L)。为避免溶媒(生理盐水)对行为学结果影响,生理盐水/生理盐水、生理盐水/苯肾上腺素、生理盐水/苯那沙坦组大鼠,先向PrL内注射0.5 μl生理盐水,停留5 min,再向PrL内分别注射生理盐水(剂量0.5 μl)、盐酸苯肾上腺素(剂量0.5 μl,浓度20 g/L)和盐酸苯那沙坦(剂量0.5 μl,浓度10 g/L)。对于需要联合注射药物(苯那沙坦/苯肾上腺素组)的大鼠,先向PrL内注射盐酸苯那沙坦(剂量0.5 μl,浓度10 g/L),注射完毕,停留5 min,再向PrL注射盐酸苯肾上腺素(剂量0.5 μl,浓度20 g/L)。所用药物剂量基于大鼠在体实验研究报道及预实验结果[12,13]。

1.5 行为学实验

所有行为学实验均在MFB内注射生理盐水或6-OHDA后第4周内进行。测试时间定于上午9 ∶00-12 ∶00间进行,检测地点选择在一间隔音的房间中进行。整个过程用HR-550E数码相机记录,结果由两名不了解实验分组情况的观察人员进行分析。

1.5.1 旷场实验 旷场实验主要用来评估PrL内注射药物或MFB损毁对大鼠自发运动能力的影响[14]。旷场装置由黑色有机玻璃围成规格为100 cm×100 cm×40 cm的结构,底及侧壁为白色,底部由黑色线条划分处25个20 cm×20 cm的方格。每只大鼠均先放置在旷场中心部位,然后观察记录大鼠穿格次数(squares crossed,水平运动)和站立次数(rearings,垂直活动)。

1.5.2 EPM实验 EPM实验主要用于评估大鼠的焦虑样行为[15]。迷宫由两条相对开放臂(50 cm×10 cm)和两条相对闭合臂(50 cm×10 cm×40 cm)及中央区(10 cm×10 cm)连接而成,迷宫放置于距离地面50 cm高处。将大鼠从中央格面向开放臂放入迷宫,记录5 min内的活动情况。出入臂定义为大鼠四肢全部出臂或入臂。计算大鼠进入开放臂的次数和在开放臂停留的时间分别占总次数(开放臂和闭合臂次数之和)和总时间(在两臂停留时间之和)的百分比。其他观察指标还包括探头(head-dipping)行为:指开放臂中把头伸出并向下探究行为,次数减少提示大鼠紧张度增加,具有焦虑样行为特征;前伸(stretched-forward)行为:指一种探究姿势,身体前伸而后回缩到起初的位置没有向前发生前移,前伸行为和探头行为作用正好相反。抗焦虑作用表现为大鼠进入开臂次数的百分比和在开臂停留时间百分比均增加,而致焦虑作用正好相反。实验完成后将大鼠取出,将开放臂和闭合臂内清理干净,喷洒酒精除去气味,测试下一只动物。

1.6 组织学与免疫组织化学

行为学实验完成后,采用4%水合氯醛(600 mg/kg,腹腔注射)对大鼠进行深度麻醉,然后应用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)150 ml快速心脏灌注,序贯4%多聚甲醛250 ml进行固定。断头,剥离脑组织,将剥离好的脑组织置于4%多聚甲醛后固定4 h,然后转移至含30%蔗糖溶液中直至沉底。在恒冷切片机上行连续冠状冰冻切片,片厚30 μm,收集包含PrL结构的组织切片行尼式染色,用于观察PrL基本结构、确定套管埋置位置。对包含黑质致密部(substantia nigra compacta,SNc)和腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)的组织切片行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色,用于观察DA神经元的变性丢失程度评估MFB损毁情况。TH染色后对SNc及VTA中DA能神经元进行计数,每只大鼠选取三张切片进行计数然后算平均值。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 PrL内的导向套管埋置及药物注射位点

图1显示大鼠PrL内用于药物注射的导向套管路径及药物注射位点,左侧为尼氏染色,右侧是相应切面模式图。

左侧尼氏染色照片示大鼠PrL内局部注射的位置(箭头所示);右侧为大鼠脑立体定位图谱显示PrL的冠状切面模式图(前囟+3.24 mm)引自文献[10]图1 PrL内用于药物注射位点Figure 1 The injection site of PrL

2.2 SNc和VTA区TH阳性神经元计数

在假手术组大鼠,与未注射侧相比,生理盐水注射侧内SNc和VTA区TH阳性神经元计数差异无统计学意义(见图2A)。在模型组大鼠,与未注射侧相比,6-OHDA注射侧VTA中的TH阳性神经元数目显著下降至(32±1)%(n=8,P<0.001,见图2B),而SNc中的TH阳性神经元几乎完全丢失。

左侧:注射侧,右侧:未注射侧;模型组大鼠注射侧SNc中的DA神经元完全丢失,VTA中的DA神经元部分丢失;MTN,medial terminal nucleus of the accessory optic tract,内侧终核;图中竖黑线代表外侧的VTA与内侧白质纤维束的分界线图2 SNc和VTA的TH免疫组织化学染色 ( ×40)Figure 2 TH immunohistochemical staining in the SNc and VTA ( ×40)

2.3 MFB损毁及PrL内α1肾上腺素受体激活和阻断对大鼠自发运动能力的影响

旷场实验中,我们检测了单侧6-OHDA损毁MFB以及PrL内分别注射生理盐水、苯肾上腺素、苯那沙坦和苯那沙坦/苯肾上腺素对大鼠水平和垂直运动能力的影响。结果显示,MFB损毁引起大鼠水平运动(穿格次数,F1,64=184.218,P<0.001,见图3A)和垂直运动(直立次数,F1,64=53.439,P<0.001,见图3B)能力显著下降。不论假手术组还是模型组大鼠,与PrL内注射生理盐水相比,PrL内注射苯肾上腺素、苯那沙坦和苯那沙坦/苯肾上腺素均未能影响大鼠的水平和垂直运动能力(见图3)。

与假手术组比较,* * *P<0.001图3 MFB损毁、激活或阻断PrL内α1肾上腺素受体对大鼠自发运动能力的影响 (n=8)Figure 3 Changes of spontaneous locomotor activity after MFB lesion, activation or blockade of α1-adrenoceptors in the PrL (n=8)

2.4 MFB损毁及PrL内α1肾上腺素受体激活和阻断对大鼠焦虑样行为的影响

在EPM实验中,采用6-OHDA单侧损毁MFB,通过导向套管向PrL内注射苯肾上腺素、苯那沙坦以及给予苯那沙坦/苯肾上腺素等药物后观察大鼠在开放臂停留时间百分比和开放臂进入次数百分比的变化情况。双因素方差分析(损毁×药物)显示损毁因素(开放臂停留时间百分比,F1,76=16.137,P<0.001;开放臂进入次数百分比,F1,76=18.820,P<0.001)和药物因素(开放臂停留时间百分比,F3,76=13.139,P<0.001;开放臂进入次数百分比,F3,76=16.380,P<0.001)均能对大鼠的开放臂停留时间百分比和开放臂进入次数百分比产生了显著影响(见图4)。进一步分析显示,与局部注射生理盐水相比,PrL内注射苯肾上腺素显著降低了假手术组大鼠在开放臂停留时间百分比和开放臂进入次数百分比(P<0.01,见图4A和B),表明诱导焦虑样反应;而对模型组大鼠,PrL内注射苯肾上腺素对开放臂停留时间和开放臂进入次数百分比的影响无显著性差异。与苯肾上腺素作用相比,苯那沙坦显著增加假手术组大鼠在开放臂停留时间的百分比(P<0.05,见图4A)和开放臂进入次数百分比(P<0.01,见图4B),表明抗焦虑样反应;对模型组大鼠,PrL内注射苯那沙坦对开放臂停留时间和开放臂进入次数百分比影响无显著性差异。假手术组大鼠预先给予苯那沙坦可以阻断苯肾上腺素的效应(P<0.05,见图4A)。

在EPM中,采用6-OHDA单侧损毁MFB,通过导向套管向PrL内注射苯肾上腺素、苯那沙坦以及给予苯那沙坦/苯肾上腺素等药物后观察大鼠探头和前伸次数的变化。双因素方差分析(损毁×药物)显示损毁因素(探头次数,F1,76=35.775,P<0.001;前伸次数,F1,76=21.074,P<0.001)和药物因素(探头次数,F3,76=33.469,P<0.001;前伸次数,F3,76=30.706,P<0.001)均能对大鼠的探头和前伸次数产生显著影响(见图4C，D)。进一步分析显示,与局部注射生理盐水相比,PrL内注射苯肾上腺素显著降低假手术组和模型组大鼠探头次数(假手术组:P<0.001;模型组:P<0.05,见图4C)和增加前伸次数(假手术组:P<0.01;模型组:P<0.001,见图4D),表明诱导焦虑样反应。与苯肾上腺素作用相比,苯那沙坦显著增加假手术组大鼠和模型组大鼠探头次数(假手术组:P<0.001;模型组:P<0.05,见图4C)和降低前伸次数(假手术组:P<0.05;模型组:P<0.01,见图4D),表明抗焦虑样反应。假手术组大鼠预先给予苯那沙坦可以阻断苯肾上腺素的效应(探头次数:P<0.001;前伸次数:P<0.05,见图4C)。模型组大鼠预先给予苯那沙坦亦可以阻断苯肾上腺素的效应(探头次数:P<0.05;前伸次数:P<0.01,见图4D)。

与假手术组比较,* * *P<0.001;与同组内注射生理盐水/生理盐水比较,#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001;与同组内注射生理盐水/苯肾上腺素比较,&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001MFB损毁后大鼠在开放臂停留时间百分比、开放臂进入次数百分比和探头次数显著下降,而前伸次数明显增加。在假手术组,PrL内注射苯肾上腺素减少大鼠在开放臂停留时间百分比、开放臂进入次数百分比和探头次数,且增加前伸次数;苯那沙坦可增加大鼠在开放臂停留时间百分比、开放臂进入次数百分比和探头次数,且减少前伸次数;预先注射苯那沙坦可阻断苯肾上腺素效应。在模型组,PrL内注射苯肾上腺素可以减少探头次数和增加前伸次数,而苯那沙坦可增加探头次数和减少前伸次数;预先注射苯那沙坦可阻断苯肾上腺素的效应图4 MFB损毁、激活或阻断PrL内α1肾上腺素受体对大鼠焦虑样行为的影响 (n=8-10)Figure 4 Effects of MFB lesion, activation or blockade of α1-adrenoceptors in the PrL on anxiety-like behaviors (n=8-10)

3 讨论

旷场实验是常用的用于评估大鼠等动物自发运动能力的方法[14,15]。本研究中,单侧损毁MFB后大鼠在旷场中水平跨格数和垂直站立次数明显下降,这与之前的研究结果一致[16,17],提示黑质-纹状体DA通路损毁后导致大鼠自发运动能力的下降此外,本研究还证实PrL局部注射α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素和拮抗剂苯那沙坦后对大鼠自发运动能力没有显著的影响,表明苯肾上腺素和苯那沙坦在焦虑行为检测中所产生的效应与大鼠的运动能力无直接联系,排除了运动能力行为评测的干扰。

焦虑是PD患者中最常见的NMS症状之一,但PD模型大鼠中是否也存在类似于人类的焦虑样的行为,目前研究尚未获得一致的结论。一些研究发现PD模型大鼠在旷场实验、EPM以及社会干预等行为学实验中具有焦虑样的行为[18,19],而另一些研究则得出不同的结论,PD模型大鼠在上述行为学实验中未能显示出焦虑样行为特征[20,21]。出现以上分歧的可能原因如下:6-OHDA损毁的部位如MFB、SNc或纹状体的不同、是完全或部分损毁的程度的不同、单侧或双侧损毁的侧别不同、行为学测试方法差异等。本研究中,与假手术组大鼠相比,MFB损毁后大鼠在EPM中的开放臂停留时间和进入次数百分比的降低和探头行为次数下降及前伸行为次数增加等,均提示损毁MFB可以诱发大鼠产生焦虑样行为,不仅在传统的反映时-空特征的焦虑样行为而且在反映紧张度相关的焦虑行为中均有明显的差异,本结果部分指标与本课题组前期结果相符[14,16,22],而反映大鼠紧张度相关的焦虑样行为的改变为首次证实,对进一步研究PD动物模型的焦虑行为改变具有重要的意义。

研究证据显示PrL作为mPFC亚区之一,是调节大鼠焦虑行为的重要脑区结构[23,24]。许多神经精神类疾病如焦虑与中枢神经系统内高水平NA的转换有关[25],且伴有mPFC功能失调[26]。研究还显示当暴露于应激条件下,mPFC存在高水平的NA释放并刺激α1肾上腺素受体而损害PFC的功能[27],而PFC中有丰富的α1肾上腺素受体表达[28]。早期研究发现:在“X”迷宫实验中,体循环应用α1肾上腺素受体激动剂(苯肾上腺素和ST587)可产生焦虑样行为,而阻断α1肾上腺素受体(哌唑嗪和百里胺)可产生抗焦虑样反应[4]。也有研究显示,通过向大鼠杏仁中央核内双侧微量注射α1肾上腺素受体拮抗剂苯那沙坦后,在社会干预(social interaction,SI)实验中可以以剂量依赖的模式阻断了SI时间的下降,表明具有抗焦虑作用[12]。但也有研究者得出不同的结论,NAc壳部内微量注射α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素后并未改变EPM实验中开放臂停留时间及开放臂进入次数等与焦虑样行为相关的参数[13]。然而,目前还没有关于激活或阻断PrL内α1肾上腺素受体后对于焦虑影响的研究数据,尤其是与PD相关的焦虑。本研究中,在假手术组PrL内局部注射苯肾上腺素方法可降低EPM实验中开放臂停留时间百分比、开放臂进入次数百分比和探头行为次数以及增加前伸行为次数等,研究结果提示:激活PrL内α1肾上腺素受体激活后产生了焦虑样效应,而阻断α1肾上腺素受体诱发产生抗焦虑样反应。此外,与假手术组大鼠相比,单侧MFB损毁制备的PD模型大鼠,局部注射苯肾上腺素后并未改变EPM中开放臂停留时间百分比、开放臂进入次数百分比等反映焦虑行为时-空特性参数,却改变了与紧张度相关的探头和前伸行为。分析原因可能与行为学评价方法的不同有关,目前还没有一种动物模型可以完美地模拟人类的焦虑行为,每种动物模型都具备各自的特点,这一点在以往的一些研究中也可以获得佐证:一项研究显示激活终纹床核的α1肾上腺素受体可以易化EPM中焦虑样行为但却没有改变SI中的焦虑行为,而另一项研究显示α1肾上腺素受体拮抗剂作用于杏仁中央核可以降低SI中焦虑反应而对EPM的焦虑行为没有影响,结果提示两种不同的行为学测试方法对于焦虑特性的反应具有两种不同维度[12]。其他可能的因素还包括MFB损毁后大鼠运动能力下降在某些焦虑评价模型中对焦虑样行为影响、药物注射是选择体循环给药还是局部给药方式的不同、激动剂或拮抗剂选择性不同等。

大量临床和动物实验研究证实黑质-纹状体通路变性导致了NA递质系统的变化,而NA递质系统的功能紊乱可以直接导致焦虑的发生。PrL接受来自LC的NA能纤维投射且表达丰富的α1肾上腺素受体[29]。本课题前期的研究已经证实PrL局部注射α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素后,可兴奋PrL中的Glu能神经元的活动[15],而Glu神经元过度活动与焦虑障碍有关,过度活动的PrL内Glu神经元是投射神经元,发出纤维支配边缘系统中主要包括杏仁核在内的许多核团,进一步可引起杏仁核等相关核团单胺类递质的改变,最终调节焦虑行为的发生,表现为诱导焦虑的产生或焦虑样行为的增强。

本实验的主要研究结果证实:①6-OHDA单侧损毁MFB后导致大鼠自发运动能力下降,并可诱发大鼠产生焦虑样行为;②在假手术组及模型组大鼠,PrL局部给予α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素可诱导大鼠产生焦虑样行为,而α1肾上腺素受体拮抗剂苯那沙坦产生了抗焦虑样效应,且两种药物对大鼠自发运动能力均没有影响。特别指出的是,不同于假手术组大鼠,模型组大鼠在药物干预后在EPM中反映常见的时-空特性的焦虑行为并未发生改变,仅是与紧张度密切相关的焦虑行为存在显著性差异。

综上所述,本研究结果证实了PrL在调节焦虑行为中的重要作用,阐明了PrL中α1肾上腺素受体参与了PD焦虑行为调节,为PD焦虑的治疗提供了新的靶点。