TERT启动子突变对原发性胶质母细胞瘤中小胶质细胞/肿瘤相关巨噬细胞极化的影响

杨孝燕,王春红,吉宏明

(山西医科大学附属人民医院神经外科,太原 030012;*通讯作者,E-mail:hongmingj@sina.com)

原发性胶质母细胞瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,占颅内恶性肿瘤的80%[1],呈侵袭性生长,恶性度最高,预后最差,手术难全切,即使进行手术联合放化疗综合治疗,其平均生存期只有50周[2]。与继发性胶质母细胞瘤不同,在原发性胶质母细胞瘤中,端粒酶逆转录酶启动子突变(TERT启动子突变,TERTp-mut)是发生率最高的基因突变[3,4],在指导患者预后方面有重要意义,尤其是联合异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase-1,IDH1)分析患者预后的意义更为明确—TERT启动子突变合并IDH1野生型的患者预后最差,TERT启动子野生合并IDH1突变型的患者预后最好,而TERT启动子野生合并IDH1野生型的患者的预后处于前两者之间[5,6],但其具体机制尚未被阐明。

侵袭性生长是胶质瘤预后差的独立危险因素,有研究证明TERT启动子突变与胶质母细胞瘤的侵袭性生长有关[7],但其中机制未被明确阐述。与胶质瘤侵袭性生长密切相关的另一研究方向是胶质瘤微环境中极化的小胶质细胞/肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs),因胶质瘤中小胶质细胞和肿瘤相关巨噬细胞在形态功能上很难区分,以下将二者统称为TAMs。TAMs分为发挥促炎作用的M1型与抗炎作用的M2型,而后者有大量研究证明其通过分泌一些因子介导免疫抑制、肿瘤生长、血管生成、肿瘤细胞迁移和侵袭性生长,并有相关研究证明其分布程度与胶质瘤级别及患者预后呈正相关,而前者则与抑制肿瘤生长有关[8,9]。M1型TAMs的标记物有诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL1、IL6、IL12、IL23、肿瘤坏死因子(TNF);M2型TAMs的标记物有精氨酸酶1(Arg-1)、IL10、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF),集落刺激因子1(CSF-1)以及S100 B蛋白、转录生长因子β1(TGF-β1)、前列腺素E2(PGE2)、甘露糖受体[10-12]等。作为炎症、免疫相关细胞,TAMs的极化方向受微环境中“因子平衡”的调节,即它会敏锐地根据微环境中的各种细胞因子的表达水平调整自己的极化方向从而发挥作用[13]。

在原发性胶质母细胞瘤中,TERT启动子突变率高、M2型TAMs分布广泛,且TERT启动子突变、M2型TAMs均与胶质母细胞瘤侵袭性生长及患者预后相关,那么二者之间是否存在一定关系呢?一项关于酒精性肝炎的研究证明TERT通过调控核因子κB(NF-κB)影响巨噬细胞的极化(M1、M2表型)从而引起炎性反应[14],故本研究拟初步探讨在原发性胶质母细胞瘤中TERT启动子突变是否会促进TAMs向M2方向极化。

1 材料与方法

1.1 组织标本及主要试剂

选取2015-2018年由山西省人民医院神经外科手术治疗并经病理科诊断为原发性胶质母细胞瘤的石蜡切片79例。选取M2型TAMs的标记物为Arg-1,M1型TAMs的标记物为iNOS。兔抗人精氨酸酶-1抗体(Arginase-1(D4E3MTM) XP Rabbit mAb,Arg-1)购自Cell Signaling Technology(CST)公司,鼠抗人诱导型一氧化氮合酶抗体(iNOS Antibody(4E5)NBP2-22119)购自Novusbio公司。酶标羊抗鼠/兔二抗及粉剂型抗原修复液(柠檬酸法)购自福州迈新生物技术开发有限公司,抗体稀释液及DAB试剂盒购自无锡傲锐东源生物科技有限公司。

1.2 实验分组及免疫组化(SP法)观察各组Arg-1、iNOS的阳性表达

石蜡标本送领星生物科技(上海)有限公司、北京泛生子基因科技有限公司进行TERT启动子基因检测,根据TERT启动子突变否将原发性胶质母细胞瘤组织标本分为TERT启动子突变组(TERTp-m)与TERT启动子野生组(TERTp-w)。两组分别用免疫组化SP法检测Arg-1、iNOS的阳性细胞表达数。保存于病理科的石蜡切片经过脱蜡、水化、高压法抗原修复、孵育一抗及二抗、DAB显色、复染及封片,后于400倍显微镜下随机选取10个视野,计数胞质或胞核黄染或棕黄色染色的阳性细胞数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 原发性胶质母细胞瘤Arg-1、iNOS的表达

阳性表达均为棕色染色,且Arg-1、iNOS均为胞核、胞质染色。而Arg-1表达与血管关系密切，有明显在血管壁、血管内、血管周表达倾向。无论TERT启动子突变组还是TERT启动子野生组镜下观iNOS阳性细胞(M1型TAMs)数均明显多于Arg-1阳性细胞(M2型TAMs)数(见图1)。

2.2 TERTp-m和TERTp-w中Arg-1、iNOS的表达

在原发性胶质母细胞瘤中,TERT启动子突变组的Arg-1阳性细胞(M2型TAMs)数较TERT启动子野生组多,差异有统计学意义(22.85 ± 10.33vs2.85 ± 1.70,P<0.05);突变组的iNOS阳性细胞(M1型TAMs)数比野生组多,但差异无统计学意义(394.20 ± 118.74vs356.34 ± 68.32,P=0.080,见表1)。

表1 TERTp-m与TERTp-w组Arg-1、iNOS阳性细胞数比较

与TERTp-w组比较,*P<0.05

3 讨论

胶质瘤微环境中的小胶质细胞/肿瘤相关巨噬细胞有两种来源,一是由中枢神经系统固有的小胶质细胞极化而来,另一种是外周循环中的单核细胞被招募到胶质瘤微环境中,二者在功能、形态上很难区分,共同发挥作用,一般通称为TAMs。静息状态下的TAMs呈细枝状的阿米巴样,为M0型,有两种极化途径:经典极化途径产生的M1型和替代极化途径产生的M2型,M2型又分为M2a、M2b、M2c三种亚型[12]。研究报道在非恶性肿瘤中以M1型为主,发挥促炎作用杀灭微环境中的病原体、促进肿瘤消融或死亡;在恶性肿瘤则以M2型为主,发挥免疫抑制、促肿瘤侵袭性生长等作用[8,11]。Arg-1在M2型TAMs的标记物中是最稳定的[10],与M1型标记物iNOS竞争底物、功能拮抗[12],故本实验选取M1型标记物iNOS、M2型标记物Arg-1。

研究中发现无论在TERT启动子突变组还是野生组,镜下均见大量的iNOS阳性细胞(M1型),几乎充满视野,且背景棕染,而Arg-1阳性细胞(M2型)则少量聚集分布,与之前的结论—恶性胶质瘤中TAMs以M2型为主—相反,对此查阅相关文献后可能的解释有以下三点:首先,因得出恶性胶质瘤中TAMs以M2型为主的结论的研究采用的M1、M2型标记物多是免疫表型标记物,比如CD163、CD16、CD68、CD11、CD206等[10,12,13],而iNOS和Arg-1是其代谢途径的酶,所以导致不同的结果,而由此可以推测,M1、M2型TAMs的代谢并不是完全分离的,二者之间可能存在交叉,也提示肿瘤及其微环境的细胞的代谢在肿瘤的发生发展中有重要作用;其次,有研究推测M1型和M2型TAMs在相互转化时可能存在某种中间形式以序贯其功能[15],由此推测,iNOS不仅仅是M1型TAMs的产物,也可能是M1、M2型转化之间存在的某种中间型的产物;最后,因TAMs对肿瘤微环境的因子变化非常敏感,会根据微环境的变化而改变极化状态[16],故进一步推测,在胶质瘤发生时,胶质瘤及其微环境介质释放某些因子招募小胶质细胞/单核细胞并促使其向M1型极化以启动机体“自卫”程序,但在肿瘤进展过程中,微环境的改变又促使TAMs向M2方向极化,极化的M2型TAMs则进一步促进肿瘤侵袭性生长,由此导致胶质瘤中M1型标记物iNOS较M2型标记物Arg-1多。此外,本研究发现Arg-1的表达与血管有明显的关系,在血管壁、血管周、血管内表达较明显,验证了M2型TAMs在促进肿瘤血管形成与肿瘤发展中扮演着重要角色的结论[8,9]。

在本研究中,TERT启动子突变组的Arg-1表达要比野生组多,iNOS表达两组无差异性,即TERT启动子突变组较之TERT启动子野生组,M2型细胞多,M1型细胞数无差异性,初步验证了TERT启动子突变促使TAMs向M2型极化的假设。TERT启动子突变是原发性胶质母细胞瘤中发生率最高的基因突变[3,4],与胶质瘤侵袭性生长有关[7],另外有关TERT启动子突变与胶质瘤患者预后的研究结论尚未统一,但在胶质母细胞瘤中结论是确定的,即有TERT启动子突变的患者预后是最差的[5,6];M2型TAMs与胶质瘤侵袭性生长和患者不良预后也有关[8,9],本研究初步证明TERT启动子突变与TAMs向M2型细胞极化,启示我们二者可能共同作用于原发性胶质母细胞瘤的侵袭性生长及患者的不良预后;而TERT启动子突变是通过何种途径调节TAMs的极化方向以及TAMs在促进原发性胶质母细胞瘤侵袭性生长、预后差的机制则需进一步研究。