自然流产患者的卵泡液代谢标志物研究*

孙振高，王晓明，王天琪，杨毅，徐凯月

（1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学， 山东 济南 250014）

自然流产是指妊娠＜28周，胎儿体重＜1 000 g而终止者[1]，属妇科常见病、多发病，其发生率高达10%～15%。近年来，随着二胎政策出台，高龄孕妇所占比例升高，导致自然流产发生率呈逐年上升趋势。自然流产病因复杂多样，除已知病因外，临床上仍有40%～50%原因不明[2]，因此探索自然流产未知病因具有紧迫性和挑战性。卵泡液（follicular fluid,FF）是卵母细胞生长发育所需要的微环境，研究FF代谢物成分可以间接反映卵母细胞质量及发育潜能。本研究旨在通过FF代谢组学筛选具有诊断价值的FF代谢标志物，为解释不明原因自然流产发生机制提供科学依据，为自然流产夫妇的生育问题作出贡献。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般资料收集2016年5月—2017年12月就诊于山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心因输卵管因素行体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）患 者 的FF。分为流产组（IVF-ET后自然流产者）40例和对照组（IVF-ET后分娩者）45例。该研究已获得本院生殖医学伦理委员会审议批准，所有对象签署知情同意书。

1.1.2 诊断标准主要参照全国统编8年制教材沈铿、马丁主编的第3版《妇产科学》[1]。

1.1.3 纳入标准①因输卵管因素行试管婴儿者；②符合自然流产西医诊断标准；③年龄24～40岁的非妊娠期及哺乳期妇女；④肝、肾功能正常，无妇科及其他全身疾病；⑤知情同意，志愿受试者。

1.1.4 排除标准①合并有心脑血管、肝、肾及造血系统等严重疾病者，精神病患者；②近半年内接受过激素类药物治疗；③对本研究使用药物过敏；④不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效及安全性判断；⑤因内分泌异常、免疫功能异常、子宫及内膜因素、创伤刺激、不良生活习惯及药物因素、胚胎和/或夫妇染色体异常、男方精液异常、环境因素等导致流产；⑥体重指数（body mass index,BMI）≥24 kg/m2。

1.2 临床研究步骤

采用促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropinreleasing hormone-a,GnRH-a）黄体期长方案，促排卵前1周期监测卵泡发育，于排卵后7 d（黄体中期）或孕酮（Progesterone,P）＞5 ng/ml，开始注射短效GnRH-a（法国益普生公司）达到垂体降调节标准（卵泡直径≤0.5 cm，血FSH、LH＜5 IU/L，E2＜50 pg/ml），约降调14～17 d即开始使用促性腺激素（Gonadotropin,Gn）启动超促排卵，根据患者体重及卵巢反应性确定Gn启动剂量，监测B超及血激素观察卵泡发育情况，适时调整药量，当≥2个卵泡的直径≥18 mm，肌内注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）10 000 IU（珠海市丽珠医药集团股份有限公司）。注射HCG后36 h进行B超引导下穿刺取卵，收集第1管淡黄色、透明、无血FF，显微镜下确认有MⅡ期卵母细胞存在，收集的FF 3 000 r/min离心15 min；将上清液分装于离心管（Eppendorf,EP）（海门市钲博实验器材厂）中，标记后直接冻存于液氮贮存罐中，8周内实验备用。

1.3 实验研究步骤

1.3.1 样品制备精密称取200μl受试者FF至玻璃试管，加入600μl甲醇（美国默克公司）∶乙腈（美国默克公司）∶水（4∶4∶2），涡旋1 min，14 000 r/min离心30 min，吸取上清液至EP管内，取5μl进样分析。

1.3.2 实验条件本实验分别采用Kinetex C18，2.1 mm×100.0 mm，2.6μm和Waters BEH Amide，100.0 mm×2.1 mm，1.7μm 2种色谱柱采集。Kinetex C18：流动相A为水相0.02%甲酸（上海斯信生物科技有限公司）；流动相B为有机相乙腈。Waters BEH Amide：流动相A为水相10 mmol甲酸胺（上海斯信生物科技有限公司）；流动相B为有机相乙腈∶水为95∶5（V/V），含10 mmol甲酸胺。2种色谱柱流速均为0.4 ml/min，柱温为40℃。质谱采用AB SCIEX Triple TOF 5600+，在正负离子模式下对数据进行采集。扫描方式为经典的数据依赖性扫描（IDA），1次一级质谱扫描（100 ms）触发10次二级质谱扫描（50 ms）。动态背景扣除（DBS）功能开启。一级扫描范围100～1 000 m/z，二级扫描范围100～1 000 m/z，气帘气35 psi，雾化气55 psi，辅助雾化气55 psi，离子源温度550℃，去簇电压100 V，碰撞电压（35±15）V。

1.3.3 代谢组学分析利用代谢组学方法对获取的多维色谱数据进行分析，并将其转化为一个矩阵，采用主成分分析法（PCA）和偏最小二乘法-判别分析法（PLS-DA）从整体上对样本进行直观、可靠和有统计学意义的分析。在得分图中每个点代表1个对应的样本，载荷图中离散点代表得分图分离的变量，离散度越高，对得分图贡献越大。通过t检验对每个变量进行计算求出P值，P＜0.05为差异有统计学意义。由此得到组间有差异性的物质质荷比，由获得的精确质量数与同位素丰度比得到匹配的分子式，根据一级和二级质谱信息鉴定这些差异物，并通过数据库搜索得到相关的代谢通路。

1.4 统计学分析

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，用两独立样本校正的t检验；计数资料以率表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

流产组与对照组患者年龄、不孕年限、BMI、基础促卵泡激素（basal follicle-stimulating hormone,bFSH）、基础促黄体生成素（basal luteinizing hormone,bLH）、基础雌二醇（basal estradiol,bE2）、基础窦卵泡 数（basal antral follicle count,AFC）、Gn天 数、Gn用量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在临床评价指标方面，两组患者受精率、优胚率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），流产组低于对照组，流产组卵母细胞质量和胚胎质量较差，说明FF代谢物水平的变化可能对卵母细胞和胚胎质量产生一定的影响；而两组患者获卵数、2PN卵裂率、冻胚移植（frozen embryo transfer,FET）及鲜胚移植（embryo transfer,ET）所占比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2。

2.2 两组样品总离子流图

采用超高液相色谱-高分辨质谱联用仪（美国SCIEX公司）分别在正离子和负离子模式下对流产组和对照组FF样品进行采集，两组样品的总离子流图见图1、2，图中峰值越高说明化合物的响应值 越高。

表1 两组患者一般资料比较（±s）

表1 两组患者一般资料比较（±s）

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表2 对照组与流产组体外受精结局比较 %

2.3 两组样品PCA得分

利用非靶向代谢组学手段对自然流产患者FF样品进行全面分析，经过峰提取、峰匹配及统计分析，两组样品分析的PCA得分图见图3、4，图中点分布越密集表示差异越小，分布越分散表示差异越大。两组在PC1维度上得到良好地分离，说明流产组FF内物质与对照组相比差异显著，自然流产患者FF内物质发生了变化。

图1 在正离子模式下两组FF样品的色谱总离子流图

图3 正离子模式下两组FF化合物的得分图

2.4 组间差异代谢物种类

图4 负离子模式下两组FF化合物的得分图

通过XCMS代谢组学软件热图分析及t检验找到有差异的化合物，并链接到Metlin数据库，根据一级和二级质谱信息，鉴定差异物，并把这些差异物通过KEGG聚类分析，指向差异通路。经鉴定共32种差异化合物，包括胆固醇类、维生素类、氨基酸类、脂肪酸类、胆酸类、溶血卵磷脂类及其他7大类，其中流产组FF中表达上调的有Dehydroepiandrosterone sulfate，LysoPC（16∶0），LysoPC（18∶1），LysoPC（18∶2），LysoPC（18∶3），LysoPC（20∶3），LysoPC（20∶4），Palmitoylglycerophosphocholine等8种化合物，表达下调的有L-valine，6-Oxohexanoate，L-Phenylalanine，2-Oxoglutarate，Linoleate，Oleic acid，Oleic acid，Docosahexaenoic acid，13，14-Dihydroretinol，Lithocholic acid，stearoylcarnitine，25-Hydroxyvitamin D3，Hydroxycholesterol，Chenodeoxyglycocholate，Trihydroxy-5beta-cholestan-26-al，13'-hydroxy-alpha-tocopherol，13'-hydroxyalpha-tocopherol，Tryptophan，LysoPC（18∶0），LysoPC（20∶5），Bilirubin等24种。见表3。

表3 流产组与对照组组间差异化合物

3 讨论

自然流产病因复杂多样，目前除感染因素、免疫因素、染色体异常等因素外，仍有40%～50%原因不明[2]。自然流产的发生大多归于母体和胚胎2方面因素，除常见因素外，母体因素还应包括卵母细胞质量，胚胎因素即指胚胎质量，而胚胎质量与卵母细胞质量直接相关。卵母细胞基因组而不是父系来源的基因组，是控制早期胚胎发育的关键，卵母细胞质量已成为影响妊娠结局的重要因素，而FF代谢物成分间接反映卵母细胞质量及发育潜能。本研究运用非靶向代谢组学的研究思路对流产组与对照组患者FF进行分析，找到有差异的化合物，这些差异物质包括胆固醇类、维生素类、氨基酸类等，现就其与自然流产相关性进行归类探讨。

3.1 胆固醇类

胆固醇是细胞膜的基本结构成分，在胎儿每个发育阶段，胆固醇的调节平衡至关重要。27-羟基胆固醇是胆固醇合成的有效抑制剂，在早孕期调节胆固醇代谢中起重要作用，如果孕早期其平衡紊乱，不能调节胆固醇代谢，则会影响滋养层细胞浸润和胎盘功能，引起流产[3]。LARKIN等[4]通过实验研究发现25-羟基胆固醇的浓度与hCG和P水平有关，其浓 度＞30μmol/L时，会导致hCG、P水平降低，影响妊娠结局，引起流产。

3.2 维生素类

免疫因素是复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）的重要因素。研究发现，妊娠期母胎界面合成的25-羟维生素D3可作为免疫调节细胞因子来预防母体的排斥反应，从而降低流产风险[5]。Treg/Th17细胞的平衡是持续妊娠的重要因素，研究发现维生素D可在Treg与Th17细胞的平衡中发挥作用，从而降低RSA的风险[6]。α-生育酚（alpha-tocopherol,α-TE）是一种脂溶性抗氧化剂，是胚胎发育所必需。ŞIMŞEK等[7]研究发现α-TE能清除过氧自由基，减少氧化应激，降低流产的发生率。MILLER等[8]通过动物实验发现，α-TE缺乏的斑马鱼可以产生活卵，但后期胚胎遭受发育障碍并死亡，因此α-TE缺乏可能与胚胎停育相关。此外，α-TE还可能通过其有效的抗氧化活性，减弱砷的致畸作用，从而降低砷暴露胎儿的死亡率，减少流产的发生率[9]。

3.3 氨基酸类

氨基酸对胚胎生长发育至关重要。吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）是降解色氨酸的细胞质酶。ZONG等[10]研究发现，IDO的缺乏与RSA相关，其机制可能为IDO抑制局部T细胞增殖，防止因免疫反应而引起的胎盘对胚胎排斥[11]，这也间接反映色氨酸对妊娠维持的重要性。FEI等[12]认为，色氨酸代谢是稽留流产的重要潜在靶标途径。ZHANG等[13]研究发现，支链氨基酸（branched-chain amino acid,BCAA）与妊娠结局密切相关，在BCAA截断值为239.10μmol/L时，BCAA水平升高的受试者流产率升高。BANERJEE等[14]对特发性反复自然流产（Idiopathic recurrent spontaneous miscarriage,IRSM）患者进行血清代谢组学分析发现，赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等在IRSM中显著升高。亮氨酸也是与胚胎发育密切相关的一种氨基酸，POGORELOVA等[15]发现，胎儿生长受限患者胎盘亮氨酸含量降低，亮氨酸水平低下影响胚胎生长发育，造成胚胎生长迟缓或死胎。

3.4 脂肪酸类

脂肪酸通常分为饱和脂肪酸（saturated fatty acid,SFA）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）及多不饱和脂肪酸，在卵母细胞成熟和胚胎发育中起重要作用。有学者研究发现，在未成熟卵母细胞体外培养期间，加入低生理浓度（1μmol/L）的二十二碳六烯酸能够改善体外卵母细胞质量，并可提高囊胚率[16]。此外，更高的MUFA摄入量可提高胚胎移植后活产率[17]。同时动物模型研究发现，SFA与受精、卵裂和囊胚形成率降低有关，而油酸可以减少其负面影响[18]。COLVIN等[19]则发现棕榈酸酯可增加合体滋养细胞死亡率，从而影响胚胎发育，造成流产。

3.5 溶血卵磷脂类

LI[20]、CHEN等[21]通过代谢组学方法研究砷、镉暴露孕妇的尿代谢变化，发现LysoPC是砷、镉代谢相关生物标志物。目前大量研究证实，砷、镉等重金属与胚胎停育的发生密切相关，这也间接反映LysoPC与自然流产的相关性[20-21]。

本研究运用FF代谢组学的研究方法，探讨自然流产患者与分娩者的FF差异代谢物，这些差异代谢物可能成为诊断自然流产的生物标志物，为自然流产的诊断、治疗及新药研发提供新方法和新思路。然而，本研究样本量较少，尚不能代表大部分自然流产患者FF水平，还需扩大样本量，以做更深一步的研究。此外，考虑到多次经阴道穿刺取卵会增加阴道流血的风险，因此研究中收集的是患者所有FF的总和，可能会对研究结果产生一定影响，因此尚需探索新方法，以求研究结果更加客观、准确。