活性维生素D3对阿霉素肾病大鼠CD2AP的影响

陈亚茹，赵丹，杨晓萍，罗星，刘馨馨，马国英

（1.石河子大学医学院，新疆 石河子 832002；2.石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002）

慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）是以肾功能损害、蛋白尿排泄率升高为主要特征的临床常见疾病[1]。近年来，随着对CKD尿蛋白分子机制的深入研究，发现肾足细胞表面维生素D受体是活性维生素D3发挥抗蛋白尿的重要靶点[2]。CD2相关蛋白（CD2AP），作为足细胞标志分子，具有维持细胞良好形态，调节细胞分化、凋亡及细胞信号转导的功能[3]。本实验研究骨化三醇对阿霉素（Adriamyicin,ADR）肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响，探讨活性维生素D3的肾保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

90只6周龄雄性SPF级健康Sprasue-Dawley大鼠，体重（200±20）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK（新）2013-0001。

1.2 实验试剂及仪器

1.2.1 主要试剂ADR（深圳万乐药业有限公司，批号：1409E1），骨化三醇（上海罗氏制药有限公司，批号：J20150011），CD2AP兔多克隆抗体（美国Bioworld Technology公司），GAPDH鼠单抗（北京康为世纪生物科技有限公司），蛋白预染Marker 26616（美国Thermo Fisher Scientific公司），免疫组织化学染色二步法检测试剂盒（北京中杉桥生物技术有限公司）。

1.2.2 实验仪器全自动生化分析仪BC6800（深圳迈瑞医疗国际有限公司），透射电子显微镜（日本Olympus Optical公司），电泳及电转膜仪（美国Bio-Rad公司），Gel Doc 2000凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.3 动物模型的复制及分组

采用随机数字表法将60只大鼠经单次尾静脉注射ADR 7.5 mg/kg复制模型，另取30只为对照组。2周后，3组随机选取6只大鼠检测24 h尿蛋白、血清总蛋白（total protein,TP）、血浆白蛋白（plasma albumin,ALB）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平，判断模型是否复制成功。将模型复制成功的SD大鼠随机均分为模型组和治疗组。治疗组给予0.25μg/（kg·d）骨化三醇灌胃治疗，对照组、模型组给予等量花生油灌胃。模型复制成功后每2周每组取6只大鼠检测24 h尿蛋白，取肾组织冷冻保存。第10周实验结束。

1.4 观察指标

1.4.1 尿蛋白、血生化检测治疗2、4、6、8和 10周后代谢笼留24 h尿，检测24 h尿蛋白。经大鼠腹主动脉采血，用全自动生化分析仪检测TP、ALB、TC、Scr水平。

1.4.2 Masson染色将4μm厚的大鼠肾组织石蜡切片梯度酒精脱蜡、脱二甲苯处理。经核染液染色60 s，浆染液染色30～60 s，黄色分色液分色6～8 min，直接用苯蓝/光绿液复染5 min左右，梯度酒精脱水，晾干，中性树胶封片。

1.4.3 透射电子显微镜实验结束时，各组随机选取 3只大鼠取其新鲜肾皮质约1 mm×1 mm×1 mm，经2.5%戊二醛初固定，1%锇酸再固定，脱水、包埋、半薄切片、定位修块，超薄切片机制成50～60 nm的超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，封片、镜检、摄像。

1.4.4 免疫组织化学染色将4μm厚的肾组织石蜡切片常规脱蜡、微波高温抗原修复，3%过氧化氢内源性过氧化物酶封闭，滴加CD2AP（1∶400）4℃孵育过夜，滴加辣根过氧化物酶标二抗，PBS漂洗3次，DAB显色，苏木精复染，透明，封片。每张切片随机选取5个肾小球视野，根据肾小球和肾小管间质单位内阳性信号面积与总面积的比值，计算CD2AP表达水平。

1.4.5 Western blotting检 测从-80℃冰 箱 取 出100 mg肾组织，加1 ml裂解液研磨（裂解液在使用前按1∶100比例加入10μl PMSF），所有操作在冰上进行。研磨充分，取上清用BCA法测定蛋白浓度，配平。加入蛋白上样缓冲液，100℃煮8 min，上样量50μg/孔。SDS-PAGE电泳浓缩胶：83 V，30 min；分离胶：100 V，1 h；电转：23 V，100 min；5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加一抗（CD2AP 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST洗，CD2AP山羊抗兔二抗（1∶5 000）和GAPDH山羊抗小鼠二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗二抗，用ECL发光试剂暗室曝光，Image Lab系统图像摄取，以GAPDH作为内参。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

注射ADR后2周，模型组与对照组2周后大鼠24 h尿蛋白和血生化检测结果比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组TP、ALB低于对照组，24 h尿蛋白、Scr、TC高于对照组，提示模型复制成功（见表1）。对照组大鼠被毛有光泽，精神状况良好，作息较规律；模型组毛皮暗淡无光，易嗜睡，反应迟缓，饮食欠佳；治疗组较模型组饮食、精神状态均有不同程度改善。

2.2 各组大鼠的24 h尿蛋白比较

实验前，3组大鼠24 h尿蛋白比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=0.369，P=0.697），具有可比性。对照组、模型组、治疗组大鼠活性维生素D3治疗2、4、6、8和10周后24 h尿蛋白比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的24 h尿蛋白有差别（F=566.288，P=0.000）。②3组大鼠24 h尿蛋白有差别（F=6 679.977，P=0.000）；模型组较对照组升高，活性维生素D3治疗后24 h尿蛋白水平降低。③3组大鼠24 h尿蛋白变化趋势有差别（F=843.349，P=0.000）。见表2和图1。

2.3 活性维生素D3对ADR肾病大鼠肾组织病理学改变的影响

Masson染色结果显示，对照组大鼠肾小球及肾小管基底膜的胶原成分被苯胺蓝染成蓝色，仅少量胶原分布，肾组织其他部分未见明显胶原沉积。模型组大鼠的肾小球和肾小管基底膜增厚，肾间质中染成蓝色的胶原纤维增多，并出现片状淡蓝色纤维样坏死。治疗组大鼠肾间质胶原纤维增生减轻，第10周末治疗效果明显，提示活性维生素D3能减轻肾小球结构的损伤。见图2。

表1 3组大鼠24 h尿蛋白和血生化检测结果比较（n=6，±s）

表1 3组大鼠24 h尿蛋白和血生化检测结果比较（n=6，±s）

组别 24 h尿蛋白/mg TP/（g/L） ALB/（g/L） Scr/（μmol/L） TC/（mmol/L）对照组 7.353±0.370 63.273±3.951 33.530±1.922 26.855±0.761 1.603±0.226模型组 33.269±2.598 44.948±6.510 21.878±3.014 57.649±4.893 3.228±0.220 t值 5.562 5.390 3.935 6.307 1.027 P值 0.004 0.043 0.037 0.031 0.001

表2 3组大鼠不同时间点的24 h尿蛋白比较（n=30，mg，±s）

表2 3组大鼠不同时间点的24 h尿蛋白比较（n=30，mg，±s）

组别 2周 4周 6周 8周 10周对照组 6.430±0.145 8.763±0.095 8.530±0.146 9.387±0.184 9.967±0.154模型组 33.233±0.963 39.390±0.224 42.983±0.845 66.063±0.723 79.163±0.563治疗组 29.850±0.130 30.083±0.219 27.490±0.341 25.998±0.459 21.153±0.323

图1 3组大鼠24 h尿蛋白变化趋势（n=30，±s）

2.4 活性维生素D3对ADR肾病大鼠肾足细胞超微结构的影响

大鼠肾组织透射电子显微镜结果显示，对照组大鼠足细胞形态结构正常，基底膜平滑均匀无增厚，钉突状足突清晰可见，向外延伸，彼此连接，细胞核形态规则。模型组大鼠足细胞足突回缩，熔蜡般广泛融合，细胞核畸形且胞内有脂滴聚集。活性维生素D3治疗后，足细胞损伤减轻，细胞核形态良好，足突完整，偶见融合与少量的脂滴凝集。见图3。

图2 3组大鼠肾组织病理学改变（Masson染色×400）

图3 3组大鼠肾组织超微结构改变（透射电子显微镜）

2.5 活性维生素D3对ADR肾病大鼠肾小球CD2AP分布的影响

免疫组织化学染色结果可以看出CD2AP主要定位于肾小球的足细胞胞浆内，呈黄褐色或淡黄色片状分布。CD2AP蛋白在对照组、模型组、治疗组的相对表达量分别为（0.094±0.002）、（0.041±0.014）和（0.080±0.019），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=19.802，P=0.000）；治疗组CD2AP蛋白表达水平高于模型组（P＜0.05），可见活性维生素D3可抑制ADR诱导大鼠足细胞CD2AP表达降低，上调肾足细胞CD2AP的表达，伴随尿蛋白减少。见 图4。

图4 ADR肾病大鼠肾组织CD2AP蛋白的表达（IHC×400）

2.6 活性维生素D3对ADR肾病大鼠肾小球CD2AP蛋白表达的影响

对照组、模型组、治疗组大鼠2、6和10周的肾小球CD2AP蛋白相对表达量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点大鼠肾小球CD2AP蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（F=111.181，P=0.000）。②3组大鼠肾小球CD2AP蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（F=4613.574，P=0.000），治疗组高于对照组和模型组。③3组大鼠肾小球CD2AP蛋白表达水平变化趋势比较，差异有统计学意义（F=95.446，P=0.000）。见表3和 图5。

表3 3组大鼠不同时间点CD2AP蛋白表达水平比较（n=30，±s）

表3 3组大鼠不同时间点CD2AP蛋白表达水平比较（n=30，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05

组别 2周 6周 10周对照组 0.854±0.105 0.864±0.201 0.896±0.067模型组 0.352±0.1501） 0.336±0.1241） 0.306±0.0171）治疗组 0.490±0.0911）2） 0.510±0.2281）2） 0.734±0.0831）2）

图5 3组大鼠CD2AP蛋白表达水平的变化趋势（n=30，±s）

3 讨论

肾小球疾病仍然是慢性和终末期肾病的主要原因。通过对动物模型的研究，学者对人类肾小球疾病的认识取得了重大进展[4]。绝大多数CKD为肾小球上皮细胞的疾病。在科研实验中，啮齿动物能更好地诱导疾病，以利于研究其进展机制，确定潜在的目标和治疗方法[5]。本实验根据文献报道，通过一次性尾静脉注射ADR 7.5 mg/kg获得非糖尿病足细胞疾病的动物模型，即ADR肾病模型[6]。2周末检测24 h蛋白尿、血生化指标显示，与对照组比较，模型组24 h尿蛋白升高，血清TP、ALB下降，Scr、TC升高；且2周末大鼠精神状态欠佳，反射迟钝，饮食量减少，提示模型复制成功。

足细胞损伤，突变或丢失都是足细胞复杂结构的物理改变，一旦足细胞足突扁平或抹失，肾小球的滤过屏障就不再完整，血管中的蛋白质泄漏至尿液中，就产生了蛋白尿[7]。蛋白尿是肾功能障碍重要的临床标志。

维生素D最活跃的代谢物是1，25-二羟维生素D，其是矿物体内平衡的中枢调节剂，对骨骼健康和矿物代谢至关重要[8]。也有研究证实在结肠直肠癌中，活性维生素D3能够抑制增殖，促进结肠癌上皮分化[5]。目前，关于CKD的研究热点是活性维生素D3如何减轻肾足细胞损伤，改善CKD的进程。研究发现，在嘌呤霉素氨基核苷肾病、ADR肾病、糖尿病肾病模型鼠中普遍存在维生素D的缺乏，给予 活性维生素D3可以减轻肾组织损伤，显著减少蛋白尿的产生[9-11]，与本研究结果有高度一致性[9-11]。笔者用ADR诱导的CKD模型肾组织损伤严重，Masson染色可见大量蓝染的胶原纤维增生，肾小管间质内可见肾小管扩张和肾间质纤维化。但肾脏纤维化是否与CD2AP蛋白密切相关，目前尚没有报道。

CD2AP是足细胞裂孔隔膜特异表达的蛋白，能维持足细胞结构和功能的完整性，CD2AP表达异常在蛋白尿的发生机制中发挥重要的作用。RUSSO等[12]研究发现，CD2AP基因敲除的小鼠，肾小球上皮细胞足突缺陷产生蛋白尿，最终肾衰竭而死。本研究发现，ADR肾病大鼠肾组织损伤严重，超微结构显示肾足细胞核畸形，足突融合，脂滴形成，CD2AP表达明显降低，这表明CD2AP表达降低是引起肾足细胞超微结构损伤的重要原因，进一步破环肾小球滤过屏障，导致滤过膜通透性增强，产生蛋白尿。活性维生素D3治疗后，CD2AP表达增强，大鼠24 h尿蛋白降低，肾组织纤维化症状减轻，足细胞超微结构显示胞核规则，胞膜光滑无增厚，足突清晰可见。

本研究通过复制ADR肾病模型，证明ADR能够诱导肾小球损伤，包括肾小球结构病理改变及足细胞超微结构的破坏，这些损伤参与慢性肾病蛋白尿的产生过程。活性维生素D3能够上调CD2AP表达，改善肾足细胞损伤，维持肾小球滤过膜的完整性，减少了蛋白尿的产生，发挥肾功能保护作用。近年来，众多学者对足细胞病、蛋白尿的分子机制和信号通路研究多集中在足细胞特异分子Nephrin引导的信号通路，而CD2AP独立于其他分子的功能研究相对较少[13]。本研究证明CD2AP在活性维生素D3治疗慢性肾病，减少蛋白尿的发生、发展机制中承担重要的角色。目前，关于CD2AP的具体分子机制尚不完善，有待研究者多维度深入探讨。