CREB1对血管性痴呆大鼠认知功能障碍的影响及机制研究*

2019-04-24方玲杨莉莉

中国现代医学杂志 2019年8期

方玲，杨莉莉

（1.杭州市第七人民医院精神三科，浙江杭州 310013；2.安徽医科大学，安徽合肥 230601）

随着血管性痴呆发病率的不断升高，探讨血管性痴呆的发病机制可为血管性痴呆的防治提供依据[1]。环腺苷酸反应成分结合蛋白1（cyclic adenylate response component binding protein 1,CREB1）在血管内皮化和血管内膜形成中具有重要作用[2]；在神经元应激性损伤后的修复、再生及存活中发挥重要调节作用。有研究发现，CREB1在抑郁症患者中水平下降[3]。本文探讨CREB1在血管性痴呆大鼠海马组织中的表达，以及对认知功能的影响和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康、清洁级、雌雄各半、体重270～290 g的SD大鼠40只[中国科学院微生物研究所，许可证号：SYXK（京）2014-0032]。

1.1.2 主要试剂CREB1过表达慢病毒载体和空载体病毒（美国Promega公司），兔抗大鼠CREB1多克隆抗体、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗鼠Bax多克隆抗体、兔抗鼠磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）多克隆抗体、兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-PKB）多克隆抗体、兔抗鼠蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）多克隆抗体、过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G及激动蛋白β（β-actin）抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及血管性痴呆模型的复制将40只大鼠根据随机数字表法分为对照组（假手术组）、模型组（血管性痴呆组）、阴性对照组（血管性痴呆+空载体病毒处理组）及CREB1过表达组（血管性痴呆+CREB1过表达病毒处理组），每组10只。采用四血管阻断法复制血管性痴呆模型[4]：将大鼠用水合氯醛麻醉成功后，在枕骨下做长1 cm水平切口，暴露大鼠第1颈椎和第1颈椎两侧横突翼孔，用电凝针烧灼两侧椎动脉，造成椎动脉永久性闭塞，缝合切口。24 h后水合氯醛麻醉大鼠，组织剪剪开颈正中线长约1 cm切口，分离结缔组织，找到颈总动脉，微血管夹夹闭颈总动脉15 min，再通10 min，共3次，缝合切口。对照组仅暴露血管，不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。

1.2.2 大鼠处理4组大鼠模型复制成功后2 d，采用脑立体定位注射病毒载体[5]：4组大鼠水合氯醛麻醉成功后，固定到脑立体定位仪上，常规备皮消毒后，沿矢状缝剪开头部皮肤，以矢状缝和人字缝交点为原点，按照脑立体定位仪图谱，钻开颅骨，垂直脑表面进针，CREB1过表达组大鼠5 min内缓慢注入2.5μl CREB1过表达载体病毒；阴性对照组大鼠5 min内缓慢注入等量空载体病毒；模型组和对照组5 min内缓慢注入等量生理盐水。缓慢退针，缝合皮肤。

1.2.3 Morris水迷宫实验4组大鼠处理后第2天进行水迷宫实验，将直径100 cm、高50 cm水池分成4个象限，将圆柱形平台放入水池中，实验前将水池注水至淹没水池平台2 cm，水迷宫实验分为定位航行试验（共4 d）和空间探索试验（第5天进行）。定位航行试验：将水池中注水至高出平台2 cm，水温保持约25℃，将大鼠依次从各个象限放入水中进行训练，每只大鼠每天上、下午分别训练4次，1次/象限，8次/d，训练2 min/次，大鼠找到平台并在平台上停留30 s。如2 min内没有找到平台，则引导其找到平台并停留30 s，然后休息2 min再进行下一次训练。大鼠找到平台的时间为逃避潜伏期，取每只大鼠训练的平均值。空间探索试验：定位航行试验结束后将水池中平台去除，次日进行空间探索试验，将大鼠放入水中，记录大鼠穿越原平台象限次数。

1.2.4 旷场实验取一个长47 cm×47 cm×40 cm的旷场，水迷宫实验结束后，将大鼠放入旷场中心方格内，在旷场上方安置摄像机，记录大鼠运动情况，记录15 min内大鼠的活动次数和活动距离。

1.2.5 大鼠海马组织CREB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PKB及PKB蛋白水平测定旷场实验结束后，水合氯醛麻醉大鼠，快速断头，冰上取出大鼠脑组织海马组织。采用Western blotting检测大鼠海马组织CREB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PKB及PKB蛋白水平：取大鼠海马组织加入RIPA裂解液，匀浆后提取海马组织总蛋白，测定蛋白浓度，经电泳、切胶及转膜，加入一抗（1∶1 000）过夜孵育，加入二抗孵育2 h，以β-actin为内参照（1∶2 000），ECL发光液显影。采用NIH1162软件（美国国立卫生研究院）分析各蛋白条带光密度值，目标蛋白水平为目标蛋白条带光密度值/β-actin条带光密度值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠旷场实验结果比较

4组大鼠旷场实验活动次数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠旷场实验活动次数低于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠旷场实验活动次数高于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。4组大鼠旷场实验活动距离比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠旷场实验活动距离短于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠旷场实验活动距离长于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠旷场实验结果比较（n=10，±s）

组别活动次数（次/15 min）活动距离（m/15 min）对照组 223.42±25.46 12.14±1.15模型组 94.35±22.74 3.15±0.97阴性对照组 96.57±23.04 3.32±1.04 CREB1过表达组 165.26±24.37 7.58±1.13 F值 66.787 156.651 P值 0.000 0.000

2.2 4组大鼠水迷宫实验结果比较

4组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠逃避潜伏期长于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠逃避潜伏期短于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。4组大鼠水迷宫实验穿越原平台次数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠穿越原平台次数低于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠穿越原平台次数高于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 4组大鼠水迷宫实验结果比较（n=10，±s）

2.3 4组大鼠海马组织CREB1蛋白水平比较

对照组、模型组、阴性对照组及CREB1过表达组CREB1蛋白相对表达量分别为（0.78±0.11）、（0.11±0.03）、（0.15±0.04）和（0.42±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=181.905，P=0.000）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠海马组织CREB1蛋白水平低于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠海马组织CREB1蛋白水平高于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。见图1。

2.4 4组大鼠海马组织凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比较

图1 4组大鼠海马组织CREB1蛋白的表达

4组大鼠海马组织Caspase-3蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠海马组织Caspase-3蛋白水平高于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠海马组织Caspase-3蛋白水平低于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。4组大鼠海马组织Bcl-2蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠海马组织Bcl-2蛋白水平低于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠海马组织Bcl-2蛋白水平高于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。4组大鼠海马组织Bax蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠海马组织Bcl-2蛋白水平高于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠海马组织Bcl-2蛋白水平低于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。见表3和图2。

表3 4组大鼠海马组织Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比较（n=10，±s）

组别 Caspase-3蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白对照组 0.15±0.05 0.94±0.12 0.12±0.04模型组 0.83±0.09 0.31±0.08 0.51±0.07阴性对照组 0.85±0.11 0.33±0.09 0.54±0.06 CREB1过表达组 0.27±0.08 0.77±0.10 0.24±0.07 F值 185.246 103.128 112.600 P值 0.000 0.000 0.000

图2 4组大鼠海马组织Caspase-3、Bcl-2 及Bax蛋白的表达

2.5 4组大鼠海马组织PI3K/PKB通路蛋白水平比较

4组大鼠海马组织PI3K蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠海马组织PI3K蛋白水平低于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠海马组织PI3K蛋白水平高于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。4组大鼠海马组织p-PKB蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、阴性对照组及CREB1过表达组大鼠海马组织p-PKB蛋白水平低于对照组（P＜0.05），CREB1过表达组大鼠海马组织p-PKB蛋白水平高于模型组和阴性对照组（P＜0.05）。4组大鼠海马组织PKB蛋白水平比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4和图3。

表4 4组大鼠海马组织PI3K、p-PKB及PKB蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

组别 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 PKB蛋白对照组 0.67±0.09 0.57±0.08 0.63±0.10模型组 0.13±0.04 0.15±0.05 0.59±0.11阴性对照组 0.16±0.05 0.18±0.06 0.64±0.09 CREB1过表达组 0.38±0.07 0.42±0.08 0.67±0.11 F值 145.731 85.079 1.032 P值 0.000 0.000 0.390

图3 4组大鼠海马组织PI3K、p-PKB 及PKB蛋白的表达

3 讨论

血管性痴呆是继阿尔茨海默病之后与年龄相关的中枢神经功能障碍性疾病。其主要由缺血性脑血管疾病所致的脑组织局部脑血流量减少、缺氧及局部缺氧等所造成的脑血管疾病，主要表现为认知功能障碍。通过抑制血管性因素、改善脑血管损伤等均可减轻血管性痴呆的认知功能障碍症状[6]。血管性痴呆的发病机制比较复杂，细胞凋亡在血管性痴呆的发病中具有重要作用。细胞凋亡是生物界一种基本的生物学显效，与细胞坏死不同，细胞凋亡指在病理因素或者外界生理因素的作用下，启动程序基因，细胞按照一定的程序控制出现自我死亡[7]。细胞凋亡是缺血、缺氧所致神经元损伤的一种形式，与多种脑血管疾病的发生关系密切。在血管性痴呆的研究中，细胞凋亡也越来越受到重视，大脑海马CA1区对缺血、缺氧很敏感，是海马组织中与学习记忆关系最密切的功能区，海马神经元的存活数量直接影响海马神经元对信息的贮存和处理[8]。研究发现，血管性痴呆大鼠海马区神经元大量凋亡丢失，海马神经元的凋亡丢失是血管性痴呆发病的病理基础之一[9]。

本文通过复制血管性痴呆大鼠模型，研究发现海马是与认知功能关系密切的解剖学部位，水迷宫实验和旷场实验是检测认知功能的常用方法。Caspase-3、Bcl-2及Bax是目前最受关注的凋亡调控基因，Caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的凋亡执行蛋白酶，其激活依赖Cyc-c的释放[10]；Bcl-2、Bax是细胞凋亡的重要调控基因，可通过线粒体途径导致Cyc-c物质的释放，从而激活Caspase-3，执行细胞凋亡。Bcl-2、Bax不仅可作为Caspase-3的上游调控基因，而且参与调节Caspase-3活性；可作为Caspase-3底物对Caspase-3下游发挥作用，Bcl-2/Bax可反映细胞的凋亡倾向，Caspase-3、Bcl-2及Bax在细胞凋亡中相互影响、相互制约[11]。PI3K蛋白参与调节细胞增殖、分化及凋亡等多种功能，PI3K由1个催化压积和1个调节亚基组成，为异源二聚体[12]；PKB为其下游重要信号通路，PI3K被激活后可以产生第二信使磷脂酰肌-醇-3，4，5-三磷酸；其磷酸化PKB蛋白的Ser308，导致PKB磷酸化，磷酸化的PKB通过下游因子调节细胞的增殖、凋亡等过程[13]。本研究结果表明，血管性痴呆模型大鼠存在认知功能障碍，其发生机制可能与血管性痴呆大鼠脑组织缺血、缺氧，造成海马组织通过PI3K/p-PKB通路促进海马神经元细胞凋亡，从而引起海马神经元损伤，导致认知功能障碍。

本文对血管性痴呆大鼠海马组CREB1水平进行研究发现，CREB与记忆关系密切，在大脑神经细胞活动时，CREB可帮助激活一些与长期记忆形成关系密切的基因，从而有利于长期记忆的形成。研究发现，记忆力强的大鼠CREB处于活跃状态[14-15]。CREB1位于2q32～q34染色体上，为CREB编码基因，具有促进血管形成，抑制神经元细胞凋亡等多种功能[16-17]。CREB1在脑缺血性疾病中具有脑保护作用[18]。抑郁症大鼠海马等脑区CREB1水平下降，其可能参与调控抑郁症的发病过程[19-20]。本研究结果表明，CREB1可能参与CREB1的发病过程，过表达CREB1可能通过激活PI3K/PKB信号通路，抑制海马神经元细胞凋亡，从而发挥神经保护作用，改善大鼠的认知功能障碍状态。

综上所述，CREB1可能通过PI3K/PKB通路抑制神经元细胞凋亡，改善血管性痴呆的认知功能障碍，CREB1有望成为血管性痴呆预防和治疗的潜在靶点。