MicroRNA-196a在喉癌组织中的表达及其 对喉癌细胞侵袭和转移的影响

冯国飞，尤慧华，张志锋

（金华市中心医院 耳鼻咽喉科，浙江 金华 321000）

喉癌治疗方法主要为手术和放化疗为主的综合性治疗，而对于转移和复发的喉癌患者5年生存率和生活质量较差。因此，探索治疗喉癌的新方法具有重要意义[1]。MicroRNA（miRNA）在恶性肿瘤中发挥癌基因和抑制基因的作用，研究miRNA在恶性肿瘤中的表达可为恶性肿瘤的靶基因治疗提供依据[2-3]。miR-196a在多种恶性肿瘤中表达异常[4-5]，可影响恶性肿瘤的侵袭和迁移，但miR-196a对喉癌细胞侵袭和迁移的影响尚不清楚。本文探讨miR-196a对喉癌细胞侵袭和迁移的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集选取2015年1月—2017年12月金华市中心医院70例喉癌患者的手术切除标本，术中采集每例患者喉癌组织和癌旁组织（距离癌组织边缘≥0.5 cm）于液氮中保存备用。患者均经病理证实，术前未接受放化疗等其他抗肿瘤治疗，签署知情同 意书。

1.1.2 细胞株人喉癌Hep-2细胞株（美国菌种保藏中心）。

1.1.3 主 要 试 剂Tanswell小 室、Matrigel胶、DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶及BCA蛋白浓度测定试剂盒等购自美国Sigma公司，兔抗人磷脂酰肌 醇-3-激 酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）多克隆抗体、兔抗人磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-PKB）多克隆抗体、兔抗人Bax多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体及辣根过氧化酶标记羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）抗体购自美国Gibco公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）试剂盒、转染试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000及Trizol试剂盒购自美国Santa Cruze公司，miR-196a引物和内参由上海天根生化科技有限公司设计并合成，pcDNA/miR-196a和pcDNA/miR-NC重组质粒购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理将人喉癌Hep-2细胞株接种到6孔板中，恒温培养箱中培养24 h，待细胞融合≥ 80%时将其分为空白对照组、阴性对照组及siRNA组，每组设7个复孔。采用LipofectamineTM2000转染试剂盒，siRNA组细胞转染pcDNA/miR-196a，阴性对照组细胞转染pcDNA/miR-NC，空白对照组不做处理。转染后再恒温培养箱中培养48 h，收集细胞备用。

1.2.2 组织和细胞中miR-196a水平测定从液氮中取出喉癌组织和癌旁组织标本各50 mg，充分研磨后加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min，提取喉癌组织和癌旁组织总RNA。取各组生长良好的喉癌细胞加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min，提取喉癌细胞总RNA。紫外分光光度计测定RNA纯度，取组织和细胞总RNA进行逆转录，取逆转录产物为模板，采用RT-PCR测定组织和细胞中miR-196a水平，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火40 s，72℃延伸5 min，共35个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算组织和细胞中miR-196a水平。

1.2.3 喉癌细胞侵袭能力测定取3组培养48 h的喉癌细胞置于EP管中（每组取1×105个细胞），加入培养基重悬。Transwell小室铺Matrigel胶，重悬后的细胞置于Transwell小室中，在小室下层加入含胎牛血清的培养基，每组设7个复孔。在恒温培养箱中培养24 h，取出小室，擦除小室内细胞，染色固定，在显微镜下观察细胞侵袭情况。

1.2.4 喉癌细胞迁移能力测定取3组培养48 h的喉癌细胞加入到24孔Transwell小室的上室（每组取1×105个细胞）。将含血清培养基加入到小室的下室，每组设7个复孔，培养48 h后取出小室，进行固定和染色，去除小室上层侧位细胞，显微镜下观察喉癌细胞迁移情况。

1.2.5 喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平测定取各组培养48 h喉癌细胞，弃去培养液，介入离心管中，加入RIPA裂解液冰浴裂解30 min，提取喉癌细胞总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒测定总蛋白纯度。采用Western blotting检测喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平。将蛋白提取液电泳分离，湿法转膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗（一抗为兔抗人PI3K多克隆抗体、兔抗人p-PKB多克隆抗体、兔抗人Bax多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体及GAPDH抗体）孵育24 h；加入二抗（辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG）孵育2 h，以GAPDH为内参，用ECL化学发光显影试剂盒进行显影。采用BioRad图像分析系统测定各蛋白条带吸光度，目标蛋白的相对表达量=目标蛋白的吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

1.2.6 喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平测定取各组培养48 h喉癌细胞，加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min，提取各组喉癌细胞总RNA。采用RT-PCR测定喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及 Bcl-2 mRNA水平，方法同1.2.5。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织和癌旁组织中miR-196a水平比较

喉癌组织和癌旁组织中miR-196a水平分为别（1.87±0.13）、（1.00±0.02），经t检验，差异有统计学意义（t=55.341，P=0.000）；喉癌组织中miR-196a水平高于癌旁组织。见图1。

2.2 3组喉癌Hep-2细胞株中miR-196a水平 比较

图1 喉癌组织和癌旁组织中miR-196a水平比较（n=70）

空白对照组、阴性对照组及siRNA组喉癌Hep-2细胞株中miR-196a水平分别为（1.00±0.01）、（0.97±0.03）及（0.42±0.05）。3组喉癌Hep-2细胞株中miR-196a水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=639.800，P=0.000）；siRNA组喉癌Hep-2细胞株中miR-196a水平低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），空白对照组与阴性对照组喉癌Hep-2细胞株中miR-196a水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 3组喉癌Hep-2细胞株侵袭和迁移能力比较

3组喉癌Hep-2细胞株侵袭和迁移能力比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；siRNA组喉癌Hep-2细胞株侵袭和迁移细胞数低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），空白对照组与阴性对照组喉癌Hep-2细胞株侵袭和迁移细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图2、3。

表1 3组喉癌Hep-2细胞株侵袭和迁移细胞数比较（个，±s）

表1 3组喉癌Hep-2细胞株侵袭和迁移细胞数比较（个，±s）

组别 侵袭细胞数 迁移细胞数空白对照组 185.26±21.35 213.24±24.35阴性对照组 182.37±22.56 211.17±23.54 siRNA组 98.19±11.47 107.46±12.07 F值 46.852 59.427 P值 0.000 0.000

2.4 3组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比较

3组 喉 癌 细 胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；siRNA组喉癌细胞PI3K、p-PKB及Bcl-2蛋白水平低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），而Bax水平高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。空白对照组与阴性对照组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2和图4。

图2 3组喉癌Hep-2细胞株侵袭能力（×200）

图3 3组喉癌Hep-2细胞株迁移能力（×200）

表2 3组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较（±s）

表2 3组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较（±s）

组别 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 Bax蛋白 Bcl-2蛋白空白对照组 0.53±0.09 0.62±0.11 0.37±0.06 0.45±0.06阴性对照组 0.51±0.07 0.61±0.12 0.38±0.05 0.44±0.07 siRNA组 0.23±0.04 0.32±0.07 0.59±0.10 0.19±0.04 F值 40.466 19.417 20.130 45.119 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图4 3组喉癌细胞中PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白的表达

2.5 3组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比较

空白对照组、阴性对照组、siRNA组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相 对 表 达 量 比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较经LSD-t检验，siRNA组喉癌细胞PI3K、p-PKB及Bcl-2 mRNA水平低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），Bax mRNA水平高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），空白对照组与阴性对照组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 3组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相对表达量比较（±s）

表3 3组喉癌细胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相对表达量比较（±s）

组别 PI3K mRNA p-PKB mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA空白对照组 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.01 1.00±0.02阴性对照组 1.01±0.02 1.00±0.01 1.03±0.02 0.98±0.01 siRNA组 0.48±0.07 0.54±0.08 1.76±0.14 0.42±0.05 F值 311.274 214.667 193.527 758.800 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

miRNAs在人类和真核生物中广泛存在，其为内源性小分子非编码RNA。在恶性肿瘤方面，miRNAs可作为癌基因或者抑癌基因参与恶性肿瘤的发生、发展[6-7]。miR-196a为miRNA家族成员之一，近年来在恶性肿瘤中的作用备受关注，其在恶性肿瘤的发生、发展中发挥类似癌基因的作用[8]，在胃癌、头颈癌及肝癌等多种恶性肿瘤组织和细胞中呈高表达，可促进恶性肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，抑制恶性肿瘤细胞的凋亡[9-10]。国外JIN等[11]研究发现，miR-196a在喉癌中表达上调，并通过下调喉癌中的p27kip1促进喉癌细胞增殖。SAITO等[12]研究发现，miR-196a在喉癌组织中表达上调，有望成为喉癌的诊断生物标志物和治疗靶点。国内关于miR-196a在喉癌组织中表达的研究较少，本文对金华市中心医院喉癌患者进行研究发现，miR-196a在喉癌组织中升高，与国外研究结果一致[11-12]。

喉癌是头颈部恶性程度比较高的恶性肿瘤之一，喉癌的复发和远处转移是影响喉癌治疗和预后的主要因素。在喉癌的早期治疗中，如能在消灭喉癌细胞的同时抑制喉癌细胞的远处转移，则对改善喉癌的预后具有重要意义。miR-196a与恶性肿瘤细胞的侵袭、转移有关。吴晓鹏等[13]研究发现，miR-196a可通过抑制ANXA1等基因的表达参与食管癌细胞的侵袭和转移。张健等[14]研究发现，沉默miRNA-196a可抑制结肠癌细胞侵袭和转移。目前国内外关于miR-196a对喉癌细胞侵袭、转移影响的研究较少，本研究发现沉默miR-196a可抑制喉癌细胞的侵袭、转移，表明miR-196a参与喉癌的侵袭、转移过程，下调miR-196a有望成为防止喉癌转移的靶点。

喉癌的发生、发展受多种信号通路调控，PI3K/PKB信号通路在喉癌细胞的增殖、侵袭和转移中发挥重要作用[15]。YANG等[16]发现，PI3K/PKB/mTOR通路参与喉癌细胞的侵袭、转移。miR-196a可通过PI3K/PKB信号通路参与恶性肿瘤的发生、发展。GUERRIERO等[17]研究发现，miR-196a为肺癌细胞中异常PI3K/PKB信号传导的关键介质。SHANG等[18]研究发现，miR-196a过表达通过PTEN/PKB/FOXO1途径促进细胞增殖，并抑制细胞凋亡。miR-196a是否通过PI3K/PKB信号通路参与喉癌细胞的侵袭转移？本文研究发现，沉默miR-196a可降低PI3K、p-PKB及Bcl-2水平，Bax水平升高。PI3K被激活后可催化产生PIP3，促使PKB被激活，激活的PKB激活其下游的靶基因，从而参与对细胞增殖、凋亡、侵袭及转移的调控作用[19]。Bcl-2和Bax为PI3K/PKB信号通路的下游基因，Bcl-2为抑制细胞凋亡基因，Bax为促凋亡基因[20-21]。沉默miR-196a可降低喉癌细胞PI3K、p-PKB及Bcl-2水平，升高Bax水平，表明下调miR-196a水平可能通过PI3K/PKB信号通路及其下游的Bcl-2和Bax基因参与喉癌细胞的侵袭和转移。

综上所述，喉癌组织中miR-196a水平升高，下调miR-196a水平可抑制喉癌细胞侵袭、转移，其机制可能为miR-196a通过PI3K/PKB信号通路及其下游靶基因抑制细胞侵袭和转移。