特发性心房颤动患者Th17细胞及其细胞因子的表达水平及相关性研究

谢文超，刘明，邹光新，林智海，姚光

（1.玉林市第一人民医院 心内科，广西 玉林 537000；2.玉林市第四人民医院 心内科，广西 玉林 537012）

心房颤动（atrial fibrillation,AF）是临床常见的心律失常，往往与脑卒中、心力衰竭密切相关。现有的成果表明AF与炎症有密切关系[1-2]。AF患者心房组织有炎症浸润，炎症反应导致心房、心室纤维化，形成炎症-纤维化恶性循环，促进AF的进展[3]。有研究证实，AF炎症浸润表现为淋巴细胞等免疫细胞在心房组织募集并释放相关细胞因子[4]。

辅助性T淋巴细胞亚群17（helper T cell 17,Th17）是CD4+T淋巴细胞的一个亚群，主要分泌白细胞介素-17（Interleukin 17,IL-17）。Th17和IL-17广泛参与心血管疾病的发生、发展。然而，Th17与特发性AF的关系如何，目前研究不多，故笔者设计本研究，以期为治疗AF提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月—2018年2月于玉林市第一人民医院心内科就诊的特发性AF患者80例。根据2010年欧洲心脏病学会指南对AF患者进行诊断分型及分组[5]。其中，阵发性心房颤动（paroxysmal atrial fibrillation,PAF）患者34例作为PAF组，慢性心房颤动患者46例作为慢性房颤组。选取年龄匹配的同期健康体检者80例作为对照组。纳入标准：根据心电图或者动态心电图提示为AF。排除标准：①器质性心脏病合并AF，包括冠状动脉硬化性心脏病合并AF、先天性心脏病合并AF、瓣膜性心脏病合并AF、肺源性心脏病合并AF及心肌病合并AF；②急性或者慢性炎症；③自身免疫性疾病如心肌炎、风湿热及类风湿性疾病等；④甲状腺功能异常；⑤严重肝、肾功能不全；⑥恶性肿瘤；⑦近期开放性手术及创伤史。本研究经本院伦理委员会批准通过，患者均遵循自愿原则。

1.2 诊断标准

PAF诊断：AF患者在发病7 d内自行终止或进行干预后终止；慢性心房颤动诊断：包括持续性或永久性AF，指患者AF持续时间＞7 d，或患者和临床医生共同决定放弃恢复和/或维持窦性心律的治疗。

1.3 主要试剂及仪器

CD4-FITC抗体、IL-17-PE抗体及IgG1-PE同型对照抗体购自美国BD公司。IL-17酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、IL-22 ELISA试剂盒及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）ELISA试剂盒购自美国RayBiotech公司，FC-500型流式细胞仪购自美国贝克曼公司。

1.4 方法

1.4.1 标本处理所有患者在清晨抽取静脉血，分别置于普通干燥管5 ml、抗凝管2 ml。2 h内将5 ml外周血在4℃、以2 000 r/min离心20 min取上层血清，-80℃保存。2 ml抗凝血按照Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。用RPMl 1640培养液+胎牛血清重悬PBMCs，加入刺激剂50μg/L佛波酯、500μg/L离子霉素及1.7μg/ml莫能霉素在37℃、5%二氧化碳CO2细胞培养箱培养4 h，PBS清洗后离心备用。加入CD4-FITC抗体，4℃避光孵育30 min，固定和破膜后均分为2管，对照管加入IgG1-PE 10μl，测定管加入IL-17-PE 10μl，避光孵育30 min，用流式细胞仪检测。

1.4.2 Th17细胞检测Th17细胞数量以IL-17+细胞数量表示，Th17细胞百分率以IL-17+细胞数量除以CD4+T细胞数量表示，用前向散射光及侧向散射光圈出淋巴细胞，以CD4+T细胞设门，检测IL-17-PE+细胞数量。流式结果分析使用FlowJo软件（美国 Tree Star公司）。

1.4.3 ELISA检 测血 清IL-17、IL-6、IL-22及MMP-9表达水平按照ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.4.4 超声心动图检测心脏彩超测量左心房内径（left atrial dimension,LAD）、右房内径（right atrial dimension,RAD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic dimension,LVDd）及左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计学软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，相关性分析用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者一般资料比较

3组患者在年龄、男性比例、高血压、糖尿病及吸烟方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 3组患者Th17细胞及其细胞因子比较

2.2.1 Th17细胞百分率对照组、PAF组、慢性房颤组患者Th17细胞百分率分别为（0.95±0.22）%、（2.98±0.38）%和（3.17±0.52）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=695.000，P=0.000）；进一步两两比较经SNK-q检验，PAF组、慢性房颤组高于对照组（P＜0.05），慢性房颤组高于PAF组（P＜0.05）。见图1、2。

2.2.2 IL-17对照组、PAF组、慢性房颤组外周血IL-17浓度分别为（11.42±5.67）、（33.64±8.95）和（38.16±11.88）pg/ml，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=170.400，P=0.000）；进一步两两比较经SNK-q检验，PAF组、慢性房颤组高于对照组（P＜0.05），慢性房颤组高于PAF组（P＜0.05）。见图3。

2.2.3 IL-6对照组、PAF组、慢性房颤组外周血IL-6浓 度 分 别 为（11.66±6.85）、（21.94±9.02）和（26.05±9.89）pg/ml，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=48.910，P=0.000）；进一步两两比较经SNK-q检验，PAF组、慢性房颤组高于对照组（P＜0.05），慢性房颤组高于PAF组（P＜0.05）。见图3。

2.2.4 IL-22对照组、PAF组、慢性房颤组外周血IL-22浓 度 分 别 为（0.33±0.24）、（0.79±0.22）和（0.91±0.38）pg/ml，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=71.230，P=0.000）；进一步两两比较经SNK-q检验，PAF组、慢性房颤组高于对照组（P＜0.05），慢性房颤组与PAF组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.3 3组患者MMP-9水平比较

对照组、PAF组及慢性房颤组患者MMP-9水平 分 别 为（194.71±86.95）、（386.52±132.41）和（541.86±200.68）ng/ml，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=95.450，P=0.000）；进一步两两比较经SNK-q检验，PAF组、慢性房颤组高于对照组（P＜0.05），慢性房颤组高于PAF组（P＜0.05）。见图4。

表1 3组患者一般资料比较

图1 3组患者Th17细胞表达流式图

图2 3组患者Th17细胞百分率比较（±s）

图3 3组患者IL-17、IL-6及IL-22浓度比较（±s）

图4 3组患者MMP-9水平比较（±s）

2.4 AF患者Th17细胞百分率与超声心动图参数的相关性

AF患者Th17细胞百分率与LAD呈正相关（rs=0.387，P=0.028），与LVEF呈负相关（rs=-0.268，P=0.035），与RAD和LVDd无相关性（rs=0.045和0.156，P=0.827和0.581）。

3 讨论

本研究发现，AF患者外周血中Th17细胞及其分泌的IL-17、IL-6及IL-22较对照组升高，而Th17细胞是一类强烈促炎细胞，表明AF与Th17细胞介导的炎症浸润相关。Th17细胞是近年来发现的CD4+T淋巴细胞亚群，其主要通过分泌的IL-17在心血管疾病中起着重要的作用。WU等[6]研究表明Th17细胞分泌的细胞因子在AF患者中高表达，提示Th17细胞参与AF的病理进程。HE等[7]发现在冠状动脉旁路移植术后出现AF的患者Th17/Treg比例失衡，其可以作为预测术后AF的准确性、特异性的指标。葛卫力等[1]的研究提示在持续性AF患者中，Th17及其细胞因子IL-17升高。这些研究都表明Th17细胞及IL-17与AF密切相关。而笔者的研究对象是特发性AF患者，排除器质性心脏病，减少临床混杂因素影响，提供更加直接的证据表明AF与炎症相关。既往研究表明，持续性或永久性AF患者的CRP水平明显高于PAF患者，提示较高的炎症因子可能与AF程度有关[8]。本研究也发现慢性心房颤动患者Th17细胞及IL-17、IL-6较PAF升高，提示慢性心房颤动的炎症水平高于PAF，表明炎症与AF进程相关。

本研究还发现，外周血IL-6在PAF及慢性心房颤动患者中高表达，与AULIN等发现血清中的CRP和IL-6在AF期间显著增加的结果是一致的[9]。CANPOLAT等[10]报道称血清IL-6水平升高与电复律和导管消融后AF复发风险增加有关。在长期随访中，血清IL-6水平与接受抗凝治疗的永久或者阵发性AF患者的不良事件和死亡率有关[11]。这些证据表明，IL-6与AF有密切联系，而IL-6是Th17细胞分泌的细胞因子之一，也就是表明，Th17细胞可以通过分泌IL-6引起心房炎症浸润导致AF。但是IL-6来源不只是Th17细胞，最近的研究表明，活化的B细胞可以通过分泌IL-6促进CD4+T细胞分化为Th17细胞[12]。所以，在免疫调控网络中，IL-6在不同的作用靶点扮演不同的角色，而IL-6如何发挥不同的生物学效应还需进一步研究。

结构重构、电重构在AF的发生发展中起着重要的作用，其中结构重塑与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）有关。而ECM的组成和变化又由MMPs调节。IYER等[13]研究发现MMP-9在心肌梗死后ECM重塑中起关键作用。本研究发现，MMP-9在PAF及慢性心房颤动患者中升高，并且在慢性心房颤动患者较PAF患者增高，提示AF与心肌重构有关。进一步研究表明，持续性AF患者血清纤维蛋白炎症生物标志物MMP-9、Ⅲ型胶原及hs-CRP水平高于无AF对照组，并且与左房容积、心房重构指数呈正相关[14]。但Th17或者IL-17如何影响MMP-9还需进一步的研究。

综上所述，PAF及慢性心房颤动患者Th17细胞激活，其分泌的IL-17、IL-6及IL-22升高，并且纤维化标志物MMP-9也高表达，与AF的进程有关，炎症和纤维化共同作用于AF的发生与发展。本研究样本量偏小，且为单中心研究，今后还需要多中心、大样本量研究进一步证实。