HPLC法测定乙肝扶正清毒颗粒中芍药苷的含量

李岩， 程洪杰，李克明

(1.山东省新泰市中医医院，山东 泰安 271200；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

目前临床上大部分乙肝抗病毒西药的副作用较大，故中草药及其复方制剂成为对乙肝治疗起协同增效、降低毒副作用的主要辅助药物[1]。本实验中乙肝扶正清毒颗粒(鲁药制再注20090419)由柴胡、赤芍、炒白术等18味中药复方组成，是我院在二十余年临床应用经验基础上研发的中药复方制剂，以扶正解毒、疏肝健脾、凉血化淤为中医配伍原则，临床上主要治疗乙型肝炎、早期肝硬化以及毒邪壅滞、气阴两虚型乙肝。

赤芍为制剂中君药，其含芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药內酯、鞣质、挥发油等成分，具有抗血栓、降脂、抗动脉硬化、抗肿瘤和保肝等作用[2-3]。为了更好地对乙肝扶正清毒颗粒进行质量控制，保证其在临床应用中更加安全有效，本文对制剂中所含主要成分芍药苷进行HPLC含量测定的方法学研究。目前大多数相关文献是以药典方法为基础，对中药复方制剂中芍药苷提取和含量测定进行研究，虽然该法适用性较好，但乙肝扶正清毒颗粒药味较多且含有大量糖类，对芍药苷提取率和含量测定形成干扰。因此，本实验优化了芍药苷的提取和含量测定方法，为该制剂的质控提供参考依据。

1 仪器、试剂与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；CP114电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；KQ-1000E超声清洗器(上海精密仪器仪表有限公司)；UPH-I-5/10/20TN超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。

1.2 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯(天津科密欧化学试剂有限公司)，其余试剂为分析纯；水为超纯水。

1.3 试药

芍药苷(批号110736-201438，中国食品药品检定研究院，含量为96.4%)；乙肝扶正清毒颗粒及阴性样品(根据处方工艺自制)；处方药材(上海雷允上中药饮片厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.2 样品供试溶液制备

供试品溶液制备：取符合制剂装量差异标准的本品内容物，混匀，研细，精密称取2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液25 mL，塞紧瓶塞，精密称定，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 min，置冷，加50%乙醇溶液补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品供试液的制备

精密称取芍药苷对照品10.04 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，完全溶解，摇匀，精密吸取5 mL上述溶液，置25 mL容量瓶，以50%乙醇溶液定容到刻度，摇匀，即得质量浓度为40.16 μg/mL的供试对照品溶液。

2.4 阴性对照样品供试液的制备

取不含赤芍的其他药味及辅料，根据乙肝扶正清毒颗粒的处方制备工艺，制成不含赤芍的阴性空白对照品，再按2.2项下样品供试液制备方法进行提取，即得阴性对照品供试液。

2.5 样品提取条件优化

2.5.1 提取溶剂考察

根据李思雨等[3-4]的方法，分别设置50%乙醇溶液、80%乙醇溶液、甲醇溶液3组溶剂，对供试品溶液提取方法中提取溶剂进行考察，对照品为2.3项下，色谱条件为2.1项下。结果见表1。

表1 提取溶剂考察

由表1可知，采用3种不同溶剂对样品中芍药苷进行提取，计算含量，结果表明，以50%乙醇溶液的提取率最高，故选用50%乙醇溶液作为提取溶剂。

2.5.2 提取体积考察

分别设置50 mL、25 mL、15 mL 3组50%乙醇溶液，对供试品溶液提取方法中提取溶剂体积进行考察，对照品为2.3项下，色谱条件为2.1项下。结果见表2。

由表2可知，以样品中芍药苷含量为指标，加入25 mL 50%乙醇溶液，即可将指标成分提取充分，故选用25 mL 50%乙醇溶液进行提取。

2.5.3 提取时间考察

分别设置15、30、60 min 3组提取时间，对供试品溶液提取方法中提取时间进行考察，对照品为2.3项下，色谱条件为2.1项下。结果见表3。

表3 提取时间考察

由表3可知，以样品中芍药苷含量为指标，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 min即可将测定成分提取充分，故选用超声(功率240 W，频率45 kHz)30 min处理样品。

2.6 色谱方法学考察

2.6.1 专属性考察

取经0.45 μm微孔滤膜过滤的上述各供试液，分别通过2.1项下色谱条件进行分析测定，结果显示供试品溶液与芍药苷对照品溶液的色谱峰在相同的保留时间内有相同的色谱峰出现，而阴性对照溶液在此保留时间处无干扰色谱峰出现，说明乙肝扶正清毒颗粒供试液中其他成分对芍药苷的分析测定不形成干扰，表明本实验方法专属性良好，结果见图1。

图1 乙肝扶正清毒颗粒芍药苷测定专属性实验HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of exclusive experiment of paeoniflorin in Yiganfuzhengqingdu Granules

2.6.2 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积A对进样质量M(μg)进行线性回归，回归方程为：A=1460M-0.8，相关系数r=0.999 9。结果表明, 本品芍药苷溶液在0.079 1～0.988 0 μg之间呈良好的线性关系。结果见表4。

表4 线性关系考察

2.6.3 仪器精密度实验

精密吸取已知浓度芍药苷对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件重复测定6次，记录峰面积，计算仪器精密度，结果表明，相对标准偏差为0.07%,仪器精密度良好。结果见表5。

表5 仪器精密度考察

2.6.4 重复性实验

取乙肝扶正清毒颗粒(批号20180106)样品6份，按上述拟定的芍药苷的含量测定方法制备供试品溶液，精密吸取各溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算芍药苷的含量，结果表明，相对标准偏差为1.01%，此方法测定本品中芍药苷的含量，重复性良好。结果见表6。

表6 重复性实验考察

2.6.5 稳定性实验

精密吸取乙肝扶正清毒颗粒供试品溶液5 mL，于25 ℃放置0、2、8、12、24 h后分别进样10 μL测定，所测峰面积相对标准偏差为0.984%，表明供试品溶液25 ℃下放置24 h内稳定性良好。

2.6.6 加样回收实验

芍药苷对照品储备液：取芍药苷对照品适量，精密称定为8.45 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得芍药苷对照品储备液(浓度为0.084 5 mg/mL)。

加样回收实验供试品溶液的制备：取6份乙肝扶正清毒颗粒(批号20180106)，研细，混匀，各精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入芍药苷对照品储备液5 mL、50%乙醇溶液20 mL，精密称定，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 min，置冷，加50%乙醇溶液补重，摇匀，过滤，取滤液，即得。

结果表明，相对标准偏差为1.02%，此方法测定本品中芍药苷的含量，加样回收率良好。结果见表7。

表7 加样回收实验考察结果(n=6)

2.7 样品含量测定

取乙肝扶正清毒颗粒5个批号的样品，每批各3份，按2.2项下方法制备样品溶液，2.1项下色谱条件测定，结果见表8。

表8 样品含量测定结果

3 讨论

乙肝扶正清毒颗粒是由枸杞子、赤芍等18味药材组成，其中赤芍为处方中君药，结合文献[5-7]，赤芍的主要指标成分为芍药苷，其专一性好，含量测定方法成熟，因此将芍药苷作为该制剂HPLC含量质控成分进行方法研究。本研究以芍药苷提取率为依据，考察了乙肝扶正清毒颗粒供试液的提取方法，对提取溶剂、提取时间、提取溶剂体积进行了考察，对比了80%乙醇溶液、50%乙醇溶液、甲醇溶液3种溶剂对提取的影响；对比了15、30、60 min 3种提取时间对提取的影响；对比了15、25、50 mL 3种提取溶剂体积对提取的影响；最终选择以25 mL 50%乙醇溶液超声处理30 min的提取方法，该方法提取样品时时芍药苷含量高，简单高效，且杂质干扰少。

本研究还对色谱条件的耐用性进行了考察，将测定条件进行微小变动，对主要变动的色谱条件包括色谱柱温、波长进行了考察，以含量为依据，考察方法的耐用性，结果不同波长、色谱柱温度测定结果相对标准偏差分别为：2.00%、0.87%，表明本方法耐用性良好。该色谱条件下，让不同工作人员按照拟定的方法进行样品测定，重现性相对标准偏差为1.30%，说明本方法重现性良好。采用大连依利特C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Krimasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)3种不同品牌色谱柱依照本法对样品进行测定，结果发现Aglient色谱柱分离度高且峰形对称，故选用该型号色谱柱[8-10]。

本研究通过对样品提取方法和色谱条件的考察，建立了乙肝扶正清毒颗粒中芍药苷HPLC含量测定的方法。该法分离度高，重现性好，可用于进行乙肝扶正清毒颗粒的质量控制。