细辛挥发油环糊精包合物制备工艺的正交试验研究

郭诚诚，高爽，王玉真，谢慧超，马学梅，容蓉，杨勇，李凌军

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

细辛为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛AsarumsieboldiiMiq. var.seoulenseNakai或华细辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根及根茎。前2种习称“辽细辛”[1]。根据《神农本草经》记载，细辛被列为上品，“细辛味辛、性温，主咳嗽、头痛脑动、百节拘挛、风湿痹痛、死肌，久服明目，利九窍轻身长年”[2]。现代研究表明，细辛的成分主要包括挥发性成分甲基丁香酚、黄樟醚、榄香酯素、细辛醚等以及非挥发性成分细辛脂素和马兜铃酸Ⅰ等[3]。其主要毒性成分为黄樟醚，不仅具有呼吸麻痹作用，而且是毒性较大的致癌物质[4]。甲基丁香酚是细辛镇咳祛痰、镇痛和麻醉的主要药效成分，而且也是含量最高的成分[5-6]，可作为药材细辛的品质评价指标[7]。挥发油性质不稳定，在空气中易挥发，且易氧化变质，使得制剂在制备和储存过程中因挥发油的不稳定性而变质[8]，故用β-环糊精包合可增加稳定性，提高生物利用度，并使挥发油固体粉末化，便于运输、储存和使用，提高疗效[9-10]。

本试验以甲基丁香酚包合率、载药率及收得率的综合评分作为衡量包合物优劣的指标[11]，通过正交设计优选了最佳包合工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限限公司)；Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱(瑞典Kromasil公司)；FA200AB型电子天平(赛多利斯有限公司)；H01-1A恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表有限公司)；KQ-250E超声清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；飞鸽TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；IKA RV8旋转蒸发仪(艾卡(广州)仪器设备有限公司)。

1.2 试药

甲基丁香酚标准品(中国药品生物制品检定所，批号111642-200301)；细辛(济南禾宝中药材有限公司，批号16050202，生产日期2016.05.02)，产自辽宁，经山东中医药大学李峰教授鉴定为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt.var.mandshuricum( Maxim. )Kitag.的根茎；无水硫酸钠；β-环糊精(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20160308)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂)；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 大孔树脂富集纯化细辛挥发油

2.2 HPLC方法学考察

2.2.1 HPLC色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温:30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长282 nm；进样量20 μL；以甲醇为流动相A，纯水为流动相B，梯度洗脱(0～20 min，60%A→65%A；20～30 min，65%A→100% A；30～35 min，100%A→100%A；35～35.1 min，100%A→60%A；35.1～45 min，60%A→60%A)。对照品及样品的色谱图见图1。

图1 色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram

2.2.2 甲基丁香酚对照品溶液制备

精密称取甲基丁香酚标准品100.05 mg置于100 mL容量瓶，加甲醇溶解稀释定容至刻度，摇匀，制成甲基丁香酚质量浓度为1.000 5 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

精密称取挥发油包合物0.5 g，置锥形瓶内，加入25 mL甲醇，超声60 min脱包合，抽滤，取续滤液1 mL置10 mL容量瓶内，甲醇定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，可得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察

精密移取对照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL，分别置10 mL容量瓶内，甲醇稀释至刻度，0.22 μm微孔滤膜滤过，按照2.2.1项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，绘制甲基丁香酚的标准曲线。结果表明，甲基丁香酚回归方程为y=17 642x+13.032，R2=0.999 3，在0.500 3 μg/mL～5.002 5 μg/mL范围内与峰面积的积分值呈良好的线性关系，见图2。

图2 甲基丁香酚标准曲线Fig. 1 Standard curve of methyl eugenol

2.2.5 精密度试验

取甲基丁香酚标准品溶液，照2.2.1项下色谱条件连续进样6次，结果甲基丁香酚平均峰面积为2 613.30，相对标准偏差为0.19%(n=6)，表明该方法精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h，照2.2.1项下色谱条件测定，结果甲基丁香酚平均峰面积为6 693.70，相对标准偏差为0.22%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性。

2.2.7 重复性试验

制备供试品溶液6份，照2.2.1项下色谱条件测定，结果甲基丁香酚平均峰面积为2 225.95，相对标准偏差为0.15%(n=6)，表明该样品处理方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率考察

精密移取已知甲基丁香酚含量的供试品溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶内，精密加入甲基丁香酚对照品200 μL，照2.2.1项下色谱条件测定，计算回收率。结果甲基丁香酚的平均回收率为103.90%,相对标准偏差为0.63%(n=6)，表明该方法准确度良好。

2.3 β-环糊精饱和水溶液法包合工艺研究

2.3.1 包合物的制备方法

采用饱和溶液法，取一定量β-环糊精与蒸馏水置锥形瓶内，在设定温度下用磁力搅拌器制成饱和水溶液。精密移取细辛挥发油500 μL，用体积分数为95%乙醇1 mL溶解，缓慢滴加至环糊精饱和水溶液中，保温搅拌至规定时间。搅拌结束后，加适量乙醚4 ℃冷藏24 h。取出后抽滤，弃去滤液，用少量乙醚洗涤，置烘箱中40 ℃干燥5 h，得挥发油环糊精包合物，称定质量。

2.3.2 单因素考察

2.3.2.1 乙醚对包合物收得率的影响

精密称取3 g β-环糊精 2份，置锥形瓶内，分别加入78 mL蒸馏水，45 ℃下用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。精密移取500 μL细辛挥发油2份，分别用1 mL 体积分数为95%乙醇溶解，缓慢滴加至环糊精水溶液中，保温搅拌至规定时间。搅拌结束后，样品1加适量乙醚4 ℃冷藏24 h，样品2不加乙醚4 ℃冷藏24 h。取出后抽滤，弃去滤液，用少量乙醚洗涤，40 ℃减压干燥5 h，得挥发油环糊精包合物，称定质量。称量后测定收得率，样品1为76.12%，样品2为60.06%。结果显示，包合物冷藏时加适量乙醚，有利于包合物的形成。

2.3.2.2 乙醇含量对包合物脱包合的影响

精密称取0.5 g包合物3份，置锥形瓶内，分别加入相同体积的体积分数分别为95%、80%、65%乙醇溶解，超声60 min脱包合，抽滤，取续滤液稀释10倍，测定HPLC，计算甲基丁香酚包合率。结果见表1。

表1 乙醇体积分数对包合率影响

由此可以看出，脱包合时的乙醇体积分数对甲基丁香酚包合率没有太大影响，考虑到实际操作更加便捷，故选择95%乙醇作为脱包溶剂。

2.3.2.3 脱包合方法的选择

精密称取0.5 g包合物6份，置锥形瓶内，用25 mL 体积分数为95%乙醇溶解，分别采用超声1 h后抽滤、超声1 h后离心、超声1 h后静置、冷凝回流1 h后抽滤、冷凝回流1 h后离心、冷凝回流1 h后静置的方法进行脱包合。经HPLC测定，计算空白回收率，结果如表2所示。

表2 不同脱包合方法对空白回收率影响

由表2结果可知，超声抽滤和回流离心的空白回收率较好，两者差距不大，说明挥发油损失率低，为使试验更加便捷，选择超声抽滤法进行脱包合。

2.3.3 甲基丁香酚包合率、收得率及载药率测定

取制备好的包合物，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，照2.2.1项下色谱条件测定，按如下公式进行计算：

其中，y0为空白回收率；y1为甲基丁香酚包合率；y2为包合物收得率；y3为载药率；x1为回收甲基丁香酚量；x2为投入甲基丁香酚量；x3为包合物中甲基丁香酚量；m1为包合物质量；m2为β-环糊精投入量；m3为挥发油投入量。

2.3.4 评价指标

综合评分加权处理时，包合率是评价包合效果的主要指标[12]，可以反映β-环糊精与挥发油量的关系，包合率愈高，包合效果愈好，影响挥发油稳定性提高效果愈大，故权重系数定为0.5；收得率在实际生产中具有重要意义，在投入量确定的情况下，收得率愈高，包合率愈高，将收得率作为次要指标[13]，其权重系数定为0.3；载药率也是控制包合质量的重要因素，权重系数定为0.2。故按如下公式计算综合评分(z)：

z=0.5y1+0.3y2+0.2y3。

通过多指标综合评价，可较全面地反应包合物的制备工艺水平,为挥发油制剂工艺的优化及新剂型的研发提供新的参考理论依据。

2.3.5 正交试验设计

表3 因素水平表

表4 正交试验结果

续表4

2.3.6 验证试验

取3份细辛挥发油，按照最佳工艺进行包合，包合物平均收得率为77.22%，相对标准偏差为2.512%(n=3)；甲基丁香酚平均包合率为74.64%，相对标准偏差为2.612%；平均载药率为8.72%，相对标准偏差为2.95%。说明该条件下甲基丁香酚包合率、载药率及包合物收得率比较稳定，因此确定该工艺合理可行，结果见表6。

表6 重复性验证试验

3 讨论

(1)β-环糊精包合方法有饱和水溶液法、研磨法和超声法，经查阅文献及预试验显示，研磨法效果略优于饱和水溶液法，但工艺费时费力，超声法效果最差，考虑到实际生产中工业条件的限制，最终选择饱和水溶液法进行包合。

(2)曾采用水蒸气蒸馏法测定包合物中挥发油含量，但试验发现空白回收率低，试验准确性无法保证。故采用HPLC测定，通过综合评分，能准确反映出挥发油药效物质的包合效果。

(3)温度对β-环糊精在水中的溶解度影响很大，随着温度的升高，β-环糊精溶解度越大，采用饱和水溶液法制备包合物时, 要根据试验温度下β-环糊精的在水中的溶解度计算所得加水量 , 使得包合过程在β-环糊精的饱和水溶液中进行, 包合后低温冷藏 , 以减少包合物的溶解 , 提高包合物的收率，可降低成本，减少服用量。大生产时应注意未包合挥发油的回收。

(4)该方法甲基丁香酚包合率为74.64%，损失了25.36%，损失部分包含该方法本身的试验误差4.94%(甲基丁香酚空白回收试验结果为95.06%)，所以实际试验中甲基丁香酚包合率要高于试验值。

(5)验证试验表明，经β-环糊精包合后，提高了挥发油中有效物质甲基丁香酚的稳定性并掩盖了不良气味，包合率较高，而毒性物质黄樟醚在经过大孔树脂脱毒后，含量仅余3.84%，经β-环糊精包合后，释放缓慢，降低其刺激作用。该方法操作简单，可用于工业化生产，也为进一步的药效评价和制剂工艺提供了质量可控的包合工艺。