跨膜蛋白16A对胚胎着床和子宫内膜容受性的影响

杨一凡，谢青贞

(武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心，武汉 430060)

胚胎着床是活性胚胎在容受态子宫内膜上进行定位、粘附、侵入从而与子宫内膜建立紧密连接的过程。胚胎只有在特定的时期才能在子宫内膜上进行着床，此时子宫内膜处于容受状态，这个时期称为“窗口期”，人一般在排卵后第7～9天(人正常月经周期第21～23天)[1]。雌激素(E2)和孕激素(P4)是调控胚胎着床的主要激素，在E2和P4的协同作用下，包括细胞因子、粘附分子、生长因子等在内的诸多分子进行时空特异性对话，LIF和整合素αvβ3于人正常月经周期中子宫内膜上高表达时间与“窗口期”开放时间同步，因此它们常作为子宫内膜容受性的标志性分子[2-3]。

跨膜蛋白16A(TMEM16A)又称ANO1(anoctamin 1)，其基因定位于人类染色体11q13区域，此区域的很多基因在上皮类癌症中高表达，因此在被确认为CaCCs的分自助基础之前，TMEM16A主要在肿瘤的发生、发展的行为表观学和机制研究中被大家熟知[4-5]。2008年3个顶级实验室证实TMEM16A是钙激活氯离子通道(CaCCs)的分子基础，由此关于TMEM16A的研究得以展开[6-8]。现已知TMEM16A在气管、胃肠道和血管平滑肌等多种器官和组织中广泛表达，并参与相应的生理反应过程[9-11]。在生殖系统中，TMEM16A被认为可以促进小鼠子宫平滑肌的收缩[12]；在大鼠卵巢颗粒细胞中同样发现了TMEM16A的表达，并通过MEK/ERK途径影响雌激素的合成[13]；在输卵管中，TMEM16A可改变输卵管平滑肌的收缩从而影响输卵管对精子、卵母细胞和受精卵的运输[14]。我们的前期研究同样证实了TMEM16A表达于人正常月经周期的子宫内膜，并于月经周期的不同时期存在差异性表达，可能受到卵巢雌、孕激素的调节[15]。我们的体外实验亦提示[16]，人子宫内膜Ishikawa细胞在E2和，P4的联合作用下，TMEM16A的表达水平明显高于空白对照组和E2以及P4单独作用组。由此，本研究拟通过细胞粘附实验比较空白对照组和T16A inh-A01组中Ishikawa细胞与滋养层细胞细胞系HTR8-Svneo粘附作用程度的差别并在子宫内膜细胞Ishikawa中加入E2、P4及TMEM16A特异性抑制剂T16A inh-A01后比较子宫内膜容受性标志分子LIF 和整合素αvβ3表达水平变化，以此探讨TMEM16A对胚胎着床和子宫内膜容受性的影响。

材料和方法

一、主要材料和试剂

子宫内膜腺癌细胞Ishikawa由华南农业大学杨增明教授馈赠，HTR8-Svneo由武汉大学人民医院范翠芳教授馈赠。炭吸附胎牛血清(Gibco，美国)、无酚红RPMI-1640培养基(Hyclone，美国)、q RT-PCR逆转录试剂盒(Takara Bio，日本)、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara Bio，日本)、TMEM16A兔抗人多克隆一抗(Abcam ab72984，英国)、LIF兔抗人多克隆一抗(Abcam ab113262，英国)、整合素αvβ3兔抗人多克隆一抗(博奥森 bs-1310R)、内参β-actin(赛维尔生物)、山羊抗兔二抗(ASPEN AS1107)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天)、5×蛋白上缓冲液(谷歌生物)、钙黄绿素-AM(翊盛生物)、T16Ainh-A01(Sigma，美国)。

二、方法

1. 细胞培养和分组

子宫内膜细胞Ishikawa为贴壁细胞，细胞复苏后置于含10%炭吸附胎牛血清的无酚红RPMI-1640培养基中，37℃，5% CO2培养。稳定传代，按2×106个/孔将细胞均匀铺在6孔板中，待细胞状态稳定后用含0.5%炭吸附胎牛血清的无酚红RPMI-1640饥饿处理，24 h后根据实验目的和实验方法对细胞进行分组和相应处理。

2.qRT-PCR法检测各组TMEM16、LIF和整合素αvβ3 mRNA在 Ishikawa中的表达水平

细胞饥饿处理24 h后，空白对照组加入0.1% DMSO，E2+P4组加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4，均培养48 h；抑制剂组加入10 μmol/L T16Ainh-A01，培养24 h；E2+P4+抑制剂组先加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4培养48 h，换液后再加入10 μmol/L T16Ainh-A01培养24 h。吸去培养基，PBS洗涤3次，按Trizol试剂说明提取各组细胞的Total RNAs，测定各组Total RNAs的浓度及OD值，若OD值在1.8～2.2之间，各组取1 μg Total RNA，按照说明书，利用逆转录试剂盒去除基因组DNA，总体系为10 μl。随后按逆转录说明书利用Applied Biosystems VeritiTM96-Well Thermal Cycle仪器(Applies Biosystem，美国)对Total RNAs进行逆转录反应，反应体系为20 μl。逆转录后用Applied BiosystemTM7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument(Applies Biosystem，美国)进行qPCR。实验独立重复3次。qRT-PCR所用引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

3.Western blot检测各组TMEM16A、LIF和整合素αvβ3蛋白在Ishikawa中的表达水平

细胞饥饿处理24 h后，空白对照组加入0.1% DMSO，E2+P4组加入10 nmol/L E2和1 μmol/L P4，均培养48 h；抑制剂组加入10 μmol/L T16Ainh-A01，培养24 h；E2+P4+抑制剂组先加入10 nmol/L E2和1 μmol/L P4培养48 h，PBS清洗3次，换液后再加入10 μmol/L T16Ainh-A01培养24 h。用TBS缓冲液润洗贴壁细胞2～3次，最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂于6孔板内裂解3～5 min。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5 ml离心管中。冰浴30 min。4℃ 13 000 g离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品的蛋白浓度，加入适量5×蛋白上缓冲液后煮沸8 min使蛋白变性，使用12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样本，然后将凝胶上分离的蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入一抗Anti-TMEM16A antibody (1∶1 000)，Anti-LIF antibody(1∶1 000)，Anti-整合素 αvβ3 antibody(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，4℃孵育过夜。PBS漂洗3遍后，二抗(1∶20 000)室温孵育1 h，再次用PBS漂洗3遍，使用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫膜并分析条带。实验独立重复3次。

4.体外细胞粘附实验检测，E2+P4组和E2+P4+抑制剂组Ishikawa细胞和HTR8-Svneo细胞间的粘附作用

细胞饥饿处理24 h后，E2+P4组加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4，均培养48 h；E2+P4+抑制剂组先加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4培养48 h，PBS清洗3次，换液，再加入10 μmol/L T16Ainh-A01培养24 h。根据相关文献报道1，利用酶标仪检测抑制剂组和空白对照组中Ishikawa细胞和HTR8-Svneo细胞之间的粘附作用。将各组Ishikawa细胞按5×104个/孔单层均匀铺在96孔板上。HTR8-Svneo在含有10%炭吸附胎牛血清和1%青链霉素的无酚红RPMI-1640中培养，加入5 μmol/L的活细胞细胞内染料钙黄绿素-AM，置于37℃，5% CO2环境中进行活细胞染色2 h。将HTR8-Svneo按4×104个/孔单层均匀铺在含有Ishikawa细胞的96孔板中，在37℃，5% CO2培养箱中共培养2 h。用PBS洗涤3遍，洗净未粘附的HTR8-Svneo细胞。用酶标仪(PerkinElmer 1420-050，美国)检测E2+P4组和E2+P4+抑制剂组之间两种细胞粘附作用的差异(钙黄绿素激发波长：485 nm；发射波长：535 nm)。实验独立重复3次。

三、统计学分析

采用SPSS 23软件，计量资料多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组计量资料比较采用非配对t检验，统计数据以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各处理因素对TMEM16A mRNA和蛋白表达的影响

qRT-PCR结果明确显示各组Ishikawa细胞中TMEM16A mRNA和蛋白的表达情况(图1A)。与空白对照组相比，抑制剂组TMEM16A mRNA的表达显著降低(P<0.01)。E2+P4组的表达水平最高(P<0.01)，与其他3组相比均具有显著差异变化(P<0.01)。E2+P4+T16Ainh-A01的表达水平显著高于空白对照组(P<0.01)。Western Blot结果与qRT-PCR结果一致(图1B)。

两组之间比较，**P<0.01图1 qRT-PCR和Western Blot检测各组Ishikawa细胞TMEM16A mRNA和蛋白表达水平

二、各处理因素对LIF、整合素 αvβ3 mRNA和蛋白表达的影响

qRT-PCR结果明确显示了各组Ishikawa细胞LIF和整合素 αvβ3 mRNA的表达水平(图1A、B)。与空白对照组相比，抑制剂组中LIF和αvβ3 mRNA水平均显著低于空白对照组(P均<0.05)。E2+P4组中LIF和αvβ3 mRNA表达水平最高(P<0.01)，加入T16Ainh-A01后LIF和αvβ3 mRNA表达显著降低(P<0.01)，但显著高于空白对照组(P<0.05)。

Western Blot结果明确显示了各组LIF和Integrin蛋白的表达水平(图1C、D、E)。Western Blot结果与qRT-PCR结果基本一致。

三、T16Ainh-A01对Ishikawa细胞和HTR8-SVneo细胞之间粘附作用的影响

体外粘附实验显示了E2+P4+抑制剂组的OD值显著低于E2+P4组，说明E2+P4+抑制剂组 Ishikawa细胞与HTR8-SVneo细胞之间的粘附作用显著小于E2+P4组(P<0.01)。

两组之间比较，*P<0.05，**P<0.01图2 qRT-PCR和Western Blot检测各组Ishikawa细胞LIF和整合素αvβ3 mRNA和蛋白的表达水平

两组之间比较，**P<0.01图3 体外细胞粘附实验检测空白对照组和抑制剂组Ishikawa细胞和HTR8-SVneo细胞的粘附作用

讨 论

胚胎着床是一个复杂的、受到精细调控的生理过程。在雌、孕激素的共同调节下，子宫内膜由非容受态转为容受态，使活化的胚胎在子宫内膜上进行定位、粘附和侵入，成功建立妊娠，其中包括粘附分子、细胞因子、细胞外基质等分子和基质金属蛋白酶等因子共同参与到胚胎着床过程中。其中LIF和整合素αvβ3常被用于评价子宫内膜容受性的指标。LIF 由雌激素诱导产生，对胚胎着床和子宫内膜基质细胞发生蜕膜化是必须的。下调LIF的表达与女性不孕中的着床缺陷相关，许多哺乳动物包括人类，LIF 在着床期的表达明显升高，表明LIF是调控着床的关键性因子[17]。整合素 αvβ3是细胞粘附分子家族的一员，通过与细胞外基质、其他细胞粘附分子和基质金属蛋白酶等相互作用，参与到广泛的生理过程中。整合素 αvβ3被证实在人子宫内膜上的表达呈周期性变化，于分泌期表达最强并与窗口期相吻合且特异性的出现于胞饮突，以上结论均支持整合素 αvβ3作为容受性标志物的学说[18-19]。

TMEM16A又称ANO1，胃肠道间质瘤蛋白1(DOG-1)，口腔癌症过表达蛋白2(ORAOV2)以及肿瘤扩增和过表达序列2(TAOS-2)，它早先在肿瘤的发生、发展等相关研究中被大家熟知，在临床上它已成为胃肠道间质肿瘤的一个生物学标记。2008年被确定为CaCCs的分子基础后，大量相关研究得以展开。我们先前的研究证实了TMEM16A在人子宫内膜及Ishikawa细胞上也存在表达并受卵巢E2、P4调节发生周期性变化[16]。

Ishikawa细胞是高分化的子宫内膜腺癌细胞，其具有E2和 P4受体并具有正常子宫内膜上皮细胞相关特性，因此常作为正常子宫内膜上皮细胞用于相关研究[20-21]。为了进一步确定TMEM16A对子宫内膜容受性的影响，我们在体外培养Ishikawa细胞，分为空白对照组、E2+P4组、抑制剂组和E2+P4组+抑制剂组。通过qRT-PCR和Western Blot技术检测各组TMEM16A和容受性分子LIF及整合素 αvβ3的表达情况。结果提示，E2+P4组中TMEM16A、LIF和整合素αvβ3的表达均显著高于其他三组(P<0.01)；抑制剂组中TMEM16A、LIF及整合素αvβ3的表达水平均显著低于其他三组(P<0.01)；E2+P4+抑制剂组中，3种分子表达水平明显高于抑制剂组和对照组(P<0.01)，显著小于E2+P4组(P<0.01)。以上结果说明，人子宫内膜上皮细胞中存在TMEM16A的表达，加入特异性抑制剂T16Ainh-A01后，TMEM16A的表达明显受到抑制，且TMEM16A表达受到抑制的同时，容受性标志分子LIF和整合素αvβ3的表达明显降低；TMEM16A在 “窗口期”时的表达显著增高，且LIF和整合素αvβ3在“窗口期”的表达达到高峰，但加入T16Ainh-A01后上述分子的高表达同样受到抑制。TMEM16A在人子宫内膜上皮细胞的的表达水平变化可影响容受性分子LIF和整合素αvβ3的表达水平，从而有可能影响子宫内膜的容受性。但具体机制还需进一步研究证明。

胚胎着床是活性胚胎在容受态的子宫内膜上定位、粘附和侵入的过程。我们通过对比E2+P4组和E2+P4+抑制剂组 Ishikawa细胞与滋养层细胞HTR8-Svneo之间的粘附能力，初步探讨TMEM16A对滋养细胞-子宫内膜上皮细胞之间粘附作用的影响。实验结果显示，与E2+P4组相比，E2+P4+抑制剂组Ishikawa细胞与HTR8-Svneo细胞之间的粘附作用明显降低(P<0.01)。提示降低子宫内膜上皮细胞TMEM16A的表达可抑制胚胎滋养层细胞与子宫内膜上皮细胞之间的粘附作用，进而影响胚胎着床。

胚胎着床的“三明治”模型提示：在子宫内膜腺上皮表面和胚泡表面均有整合素αvβ3的表达。作为骨桥蛋白(OPN)的受体，子宫内膜和胚泡上的整合素αvβ3均可以和OPN结合。OPN夹在两个整合素分子之间，形成了一个识别复合物，介导胚泡与子宫内膜的交互对话和胚泡-子宫内膜的粘附作用。在“窗口期”，整合素αvβ3受甾体激素和一些生长因子、细胞因子的调控，从而表达显著增加，使子宫内膜达到最大的容受状态，促进胚胎像子宫内膜上粘附。我们的结果表明，在E2和P4的作用下，抑制TMEM16A的表达，整合素αvβ3表达减少的同时，滋养细胞和子宫内膜细胞之间的粘附作用显著降低，提示TMEM16A可能影响整合素αvβ3的表达从而调控胚胎与子宫内膜的粘附。