MiR-483在人稽留流产胎盘绒毛组织中表达模式

2019-04-19董艺超宁安凤朱旗马旭夏红飞

生殖医学杂志 2019年4期

董艺超，宁安凤，朱旗，马旭*，夏红飞*

(1.国家卫生计生委科学技术研究所遗传优生中心，北京 100081；2. 北京协和医学院研究生院，北京 100730；3. 佳木斯大学生命科学院，佳木斯 154007)

MicroRNA (miRNA) 是一类长度为18～24 nt的单链非编码RNA分子，广泛存在于各种动植物体内，其在转录后基因表达调控中发挥重要作用[1-2]。许多研究显示miRNAs在受精卵发育、胚胎植入和复发性自然流产等生殖疾病中发挥重要作用[3-5]。稽留流产(MA) 又称为过期流产或死胎不下，通常指妊娠20周之前胚胎或胎儿已经死亡并且滞留在宫腔内未能及时自然排出者[6]。近年来，稽留流产呈现出明显上升的趋势，造成稽留流产的原因较多，但机制尚不明确。MiR-483是一个在肿瘤发生中起重要作用的miRNA[7-8]，胚胎植入过程中滋养层细胞的侵润与肿瘤的迁移非常相似[9]，胚胎植入失败是引起自然流产的重要原因，稽留流产是一种特殊性的自然流产，但现阶段miR-483是否与稽留流产相关尚不清楚。本研究通过对收集的稽留流产胎盘组织进行miR-483表达模式的分析，以期为深入探究miR-483在稽留流产中的作用提供有价值的参考资料。

资料与方法

一、研究对象

80例稽留流产患者绒毛组织是从石家庄第六医院收集，并且及1：1匹配正常人工流产孕妇的绒毛组织。年龄20～40岁，孕周8～12 w。排除染色体异常、感染性疾病、生殖器官异常、免疫功能障碍以及内分泌失调等情况。依据《妇产科学》制定了稽留流产的诊断标准[10]。运用统计学的方法分析两组患者的一般资料后，未出现显著性差异(P>0.05)，具有可比性。

二、方法

1. 主要试剂：聚偏二氟乙烯(PVDF)，Bestar©SybrGreen qPCR Mastermix(DBI，德国)，地高辛杂交液以及抗体(Roche，德国)，TRIzol reagent(Invitrogen，美国)，miRNA cDNA Synthesis Kit(ABM，加拿大)，miR-483 qRT-PCR Primer Set(RIBBIO，广州)，miR-483 地高辛探针(上海生工，上海)。

2. 总RNA的提取：取50～100 mg绒毛组织样品，用已灭菌的剪刀将组织剪碎，加入1 ml Trizol，用匀浆器破碎至匀浆，收集上清转入Eppdoff管，室温静置5 min加入0.2 ml三氯甲烷，涡旋15 s，室温静置30 min后，于4℃离心机中 12 000 rpm离心15 min，取上清液至新的Eppdoff管中，加入2倍上清体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，4℃ 12 000 rpm离心10 min后弃去上清液，加入1 ml DEPC水配置的 75%乙醇，4℃ 12 000 rpm离心5 min，倒尽液体，除去管底残液，自然干燥3 min，加入适量DEPC水溶解进行浓度测定。

3. 定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)：取500 ng Total RNA、miRNA cDNA Synthesis Kit、miR-483 反转录引物、DEPC水按照说明书进行反转录，反应体系为10 μl。反应条件：42℃ 30 min，70℃ 10 min。用反转录得到的产物cDNA作为模板，依据Bestar®SybrGreen qPCR Master mix的使用说明书，选用10 μl的反应体系，并以U6作为内参，扩增条件为：95℃ 2 min，95℃ 10 s和 60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。用2-ΔΔCt法计算miRNA相对表达量。每个样品检测三个复孔，实验进行三次重复。

4. 原位杂交：石蜡切片经烤片脱蜡至水化后，经0.2 mol/L的盐酸处理后，滴加适量蛋白酶K，再用4%多聚甲醛进行固定，然后置于预杂交液中，42℃预杂交1 h。将地高辛标记的miR-483探针加热至80℃并持续10 min，将变性好的探针与与杂交液，按照1∶250的比例进行稀释后滴加到玻片上，40℃杂交过夜。2×SSC缓冲液洗片后，在湿盒中用封闭剂室温孵育30 min后，加入稀释好的抗地高辛抗体4℃孵育过夜。恢复至室温后用NBT/BCIP显色。显色结束后用PBS清洗拨片，梯度脱水后用中性树脂封片。采用地高辛标记的LNA-scrambled探针进行杂交来作为阴性对照

三、统计学分析

结果

1.稽留流产胎盘绒毛组织中miR-483的总体表达模式

80例稽留流产和正常对照胎盘绒毛组织不分组整体分析显示，miR-483在稽留流产患者胎盘组织中有上调的趋势，但没有显著性差异 (图1)。

图1 qRT-PCR方法检测miR-483在稽留流产胎盘组织中总体表达模式

2. miR-483随年龄增长在稽留流产胎盘绒毛组织中的表达变化

年龄与稽留流产的发生密切相关，因而依据患者的年龄将其分为四组，依次为：周龄小于等于25岁(Y≤25)、26～30岁(Y 26～30)、31～35岁(Y 31～35)、大于等于36岁(Y ≥ 36)。将qRT-PCR的检测结果按照年龄段整体分析显示：与对照组相比，稽留流产患者胎盘绒毛组织中miR-483的表达在Y≤25组明显降低(P<0.01)；在Y 26～30组显著降低(P<0.01)；在Y 31～35组明显上调(P<0.05)；在Y≥ 36组没有明显变化(图2)。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图2 qRT-PCR方法检测miR-483在不同年龄段稽留流产胎盘组织中总体表达模式

3.不同年龄组稽留流产胎盘绒毛组织中miR-483表达量的个体化差异

对不同年龄段配对的MA组和对照组进行miR-483表达趋势分析，统计具有显著性差异的表达趋势的阳性率。分析发现，在Y≤25组，miR-483的表达在100%MA患者的胎盘绒毛组织中明显下调(P均<0.01)；在Y 26～30组，80%MA患者绒毛组织中miR-483表达明显下调(P<0.05和P<0.01)；在Y 31～35组，30%MA患者绒毛组织中miR-483表达下调(P<0.05 或P<0.01)，10%MA患者绒毛组织中miR-483表达明显上调(P<0.05)，其余MA患者miR-483的表达没有明显差异；在Y ≥ 36组，20%MA患者绒毛组织中miR-483表达均明显下调(P<0.01)，20%MA患者绒毛组织中miR-483表达上调(P<0.05或P<0.01)，其余MA患者miR-483的表达没有明显差异(图3)。

4.在稽留流产胎盘绒毛组织中miR-483的表达位点

由于Real-time 结果显示在30岁以下MA患者胎盘绒毛组织中miR-483的表达量主要表现为下调，而在30岁以上的MA患者中并未呈现出显著的趋势，因此，在接下来的检测中，将MA患者以30岁为界分成两个组别(图4)。原位杂交分析miR-483的表达定位结果显示，无论在MA组还是对照组，miR-483的阳性信号主要定位于胎盘绒毛合体滋养层和间质细胞。在Y≤ 30时，对照组miR-483的阳性信号强于MA组，在Y≥30时，对照组的miR-483阳性着色强度与MA组接近。

A：Y ≤25组的miR-483差异表达结果；B：Y 26～30组的miR-483差异表达结果；C：Y 31～35组的miR-483差异表达结果；D：Y ≥36组的miR-483差异表达结果；与匹配的对照组比较,**P<0.01，*P<0.05图3 qRT-PCR方法检测miR-483在不同年龄段稽留流产胎盘组织中表达的个体化差异

上图×100，下图×200，红色箭头表示miR-483阳性信号图4 原位杂交法检测在稽留流产胎盘组织中miR-483的表达位点

讨论

稽留流产作为妇产科的一种常见疾病发病因素很多，但确切的致病机制现阶段尚不明确，流行病学调查研究的结果表明[10-11]，大约有2%的处于妊娠10-14周的单胎孕妇会发生稽留流产，且我国稽留流产的发生率已经超7%，而且近年来呈现出逐渐上升趋势。现阶段已有研究表明miR-483与胃癌、肝癌、肾上腺皮质癌等密切相关[7，12-13]。众所周知，胚胎植入过程中滋养层细胞的浸润与肿瘤的迁移非常相似[9]，胚胎植入失败会引起自然流产的发生，而miR-483是否与自然流产的一个特殊类型稽留流产相关尚不清楚。本研究首次报道了miR-483在稽留流产绒毛组织中的表达模式，并为了进一步揭示miR-483与稽留流产的关系奠定了基础。

本研究利用采集的稽留流产胎盘绒毛组织，对miR-483的表达模式进行分析，发现当孕妇年龄在30岁以下时，miR-483表达明显降低，而当孕妇年龄在30岁以上时，miR-483在对照组与病理组中的表达水平并未发现有明显的差异，由此可知，miR-483的表达水平在孕妇30岁前后表现出的差异可能与年龄的改变密切相关。而很多学者的研究显示孕妇的年龄与各种妊娠疾病的发生高度相关[14-15]，miR-483的差异表达是否影响稽留流产的发生将是我们进一步研究的方向。

MiR-483表达下调可以抑制癌症细胞的生长和浸润[16]，但其在胎盘组织细胞中的作用机制尚不清楚。我们利用原位杂交技术定位了miR-483的结果显示，miR-483主要表达于合体滋养层细胞和间质细胞中，有研究表明这两类细胞在胎儿生长发育过程中，特别是在胎盘血管形成，以及子宫胎盘间的循环体系建立过程起到了重要作用[17-18]。本研究发现当孕妇年龄≤30时，miR-483在稽留流产胎盘组织中表达水平呈现下调，而这一趋势可能抑制了合体滋养层细胞和间质细胞的增殖与浸润能力，引起胎盘发育异常，母婴间物质交换障碍，不利于营养的输送，进而引起胎儿发育停止，诱导了稽留流产的发生。

综上所述，miR-483在小于30岁稽留流产患者胎盘组织表达降低，其主要定位于合体滋养层和间质细胞中。miR-483表达下调具体的功能以及其靶基因的相关蛋白的生物学功能还有待于进一步阐明。但相信，随着对miR-483的分子机制和生物学功能与疾病之间的关系的进一步研究，胎盘组织中 miR-483的表达水平对稽留流产早期诊断方面可能展现出广阔的临床应用前景。通过对人稽留流产胎盘绒毛组织中miR-483表达模式的分析，以期为今后深入研究miRNAs在稽留流产中的作用提供参考。