谷氨酰胺对多囊卵巢综合征大鼠氧化应激相关指标的调节作用

胡雪，吴庚香，杨菁

(武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心，武汉 430060)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，临床表现为月经稀发或闭经、不孕、多毛、痤疮，常伴有腹型肥胖和胰岛素抵抗，远期可有糖尿病、心血管疾病、代谢综合征等并发症，严重影响女性身心健康。PCOS的病因和发病机制至今尚不清楚，近年来研究发现，氧化应激反应和慢性炎症反应与PCOS的发病机制密切相关。谷氨酰胺(Gln)是人体含量最为丰富的游离氨基酸和重要的氮运载体和供体，能被氧化释放能量，在体内参与能量代谢、生物合成、抗氧化及细胞信号转导等生理过程[1]，常作为一种肠内营养物在临床中广泛应用。本研究对PCOS大鼠模型给予Gln干预，通过检测大鼠体内氧化应激指标变化，探讨Gln对PCOS大鼠体内氧化应激水平的调节作用，以期为PCOS的治疗提供新的途径。

材料与方法

一、实验动物与分组

30只21日龄未成年雌性SD大鼠，购自武汉大学实验动物中心，随机分为对照组、PCOS组、PCOS+Gln组，每组各10只，各组大鼠分笼编号喂养。

二、主要试剂及器材

脱氢表雄酮(上海阿拉丁试剂有限公司)；丙氨酰谷氨酰胺注射液(北京双鹤药业股份有限公司)；激素ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；氧化应激指标生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)；酶标仪(Biotek，美国)

三、研究方法

1.动物模型构建：SD大鼠PCOS动物模型构建参考Di等[2]的研究，方法如下：所有大鼠均于21日龄断乳，进食普通饲料，自由饮水，适应性喂养2 d，自23日龄起，PCOS组及PCOS+Gln组每日18：30～20：00颈部皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)60 mg/kg(溶于0.2 ml橄榄油)，对照组每日颈部皮下注射等量橄榄油，连续注射20 d。造模完成后次日晨8：00，PCOS+Gln组腹腔注射谷氨酰胺0.75 g/kg，方法参考Kim等[3]的方法，PCOS组及对照组腹腔注射等量生理盐水，12：00各组大鼠再次给予相同处理，当日20：00起所有大鼠禁食12 h后，断尾采血，吸入异氟烷麻醉，下腔静脉采血及取双侧卵巢组织，血液离心取血清保存于-80℃，一侧卵巢组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，另一侧卵巢组织保存于-80℃。

2.血清激素、胰岛素和空腹血糖测定：血糖测定取尾静脉血，血糖仪检测随机血糖，下腔静脉血检测睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)，胰岛素(INS)，按ELISA试剂盒说明书进行操作，简单介绍如下：用碳酸盐缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml，在聚苯乙烯酶标板的每孔加100 μl，4℃过夜进行包被，每孔加入封闭液并洗涤。加适当稀释的待检样品100 μl于已包被的反应孔中，同时做空白孔和倍比稀释的标准品孔，封板膜封板后置37℃孵育1～2 h，于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100 μl，37℃孵育1 h，洗涤后于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100 μl，37℃避光孵育30 min，于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反应10～30 min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。于各反应孔中加入2 M硫酸100 μl终止反应，在酶标仪上，于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度值，根据标准品的浓度和OD值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度。

3.血清氧化应激水平测定：氧化应激指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)，参照各自相应的生化试剂盒进行检测，设置空白管、标准管和测定管，分别按说明书加入相应的试剂和显色剂，最后用酶标仪测定各管吸光度值并计算样品各指标的含量。

四、统计学分析

结 果

一、各组大鼠卵巢组织学观察

各组大鼠卵巢组织HE染色结果显示对照组大鼠卵巢可见不同发育阶段的卵泡及多个黄体形成，卵泡颗粒细胞层较多，成熟卵泡内有卵母细胞和放射冠，而PCOS组和PCOS+Gln组大鼠卵巢表面见较多囊性扩张的卵泡，卵泡膜细胞增生，颗粒细胞层明显减少，卵泡内无卵母细胞和放射冠，较少有黄体形成(图1)。

图1 各组大鼠卵巢HE染色×100

二、血清激素及代谢指标检测结果

与对照组相比，PCOS组和PCOS+Gln组大鼠血清睾酮、黄体生成素浓度均明显升高，仅PCOS+Gln组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平显著升高 (P<0.05)；与PCOS组相比，PCOS+Gln组大鼠血清睾酮、空腹胰岛素和空腹血糖显著升高 (P<0.05)(表1)。

三、血清氧化应激指标检测结果

与对照组相比，PCOS组大鼠血清MDA、NO和NOS浓度均显著升高，SOD浓度显著下降 (P均<0.05)；与PCOS组相比，PCOS+Gln组大鼠血清MDA、NO和NOS浓度均显著下降，而SOD浓度显著升高(P均<0.05)(图2)。

表1 各组大鼠血清激素及代谢指标浓度的比较(-±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与PCOS组比较，#P<0.05

与对照组比较，*P<0.05；与PCOS组比较，**P<0.05图2 各组大鼠血清氧化应激水平的比较

讨 论

由于PCOS的病因不清，目前对于PCOS患者的治疗并不能根治，主要是抗雄激素、增加胰岛素敏感性、促进排卵和预防远期并发症。Gln虽然在临床应用广泛，但在生殖内分泌疾病中应用极少，因PCOS发病与氧化应激反应密切相关，而Gln具有抗氧化作用，本研究首次将Gln应用于PCOS大鼠模型，具有创新性和新颖性。PCOS动物模型构建方法有多种，本研究中采用简便、可行性高的连续皮下注射DHEA方法构建PCOS大鼠模型，结果显示在DHEA诱导下SD雌性大鼠的卵巢组织呈现多囊样改变，并且内分泌改变也与PCOS患者相似，再次证明了这种造模方法的稳定性，为本研究检测各组大鼠体内氧化应激水平变化及给予Glu干预结果的准确性奠定了基础。

机体在生理状态下，氧化与抗氧化反应处于动态平衡中，而当机体活性自由基产生过多或抗氧化能力降低，氧化还原过程失衡，则会发生病理反应，引起糖化氧化作用、脂质氧化损伤、蛋白质过氧化反应以及DNA损伤，导致细胞凋亡、组织器官损害和疾病的发生[4]。NO是一种活性氮，参与氧化反应；NOS能提高NO的含量和活性；MDA是脂质氧化终产物，反映了细胞膜受损程度；SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，具有抗氧化作用。大量研究[5-6]表明，PCOS患者体内氧化与抗氧化失衡，PCOS患者血清及动物模型卵巢组织均存在MDA水平增高和SOD水平降低的现象，本研究中，DHEA诱导的PCOS大鼠血清MDA水平较对照组升高，SOD水平较对照组降低，与上述研究结果相同。PCOS患者体内NO水平变化观点不一[7-8]，本研究结果显示与刘广南等[7]研究一致，PCOS大鼠体内NO及NOS水平升高。氧化应激与PCOS的胰岛素抵抗、高雄激素血症、不孕等均有密切联系[9-10]，对PCOS的发生发展有重要影响，还可能影响PCOS患者行体外受精-胚胎移植的临床结局[11]，张丹等[12]发现对PCOS患者用炔雌醇环丙孕酮片联合维生素C及维生素E(抗氧化剂)口服治疗3个月后，MDA水平下降，而SOD水平升高，且联合治疗组的PCOS患者月经恢复情况也比单用炔雌醇环丙孕酮片理想。

Gln是一类人体非必需氨基酸，有改善疾病预后，提高免疫力的作用[13]。其作为抗氧化物谷胱甘肽的前体，可以提高体内谷胱甘肽的水平，增强氧化防御功能，减轻氧化反应和炎症反应；还可以通过诱导热休克蛋白70的表达及抑制细胞凋亡，发挥抗氧化效能[14-15]。Gln在各种疾病导致的急危重症、胃肠手术后、烧伤创伤及肿瘤等疾病中应用广泛，但在生殖内分泌相关疾病中极少应用。本研究对PCOS大鼠给予Gln短期治疗后，血清MDA、NO、NOS水平显著降低，而SOD水平明显升高，证明Gln对PCOS大鼠体内的氧化应激水平也有调节作用。抗氧化剂中药在提高PCOS大鼠体内抗氧化能力的同时，可改善PCOS大鼠胰岛素抵抗和高雄激素血症[7]，并且Mansour等[16]对2型糖尿病患者连续给予Gln 6周后发现其能降低空腹血糖和胰岛素，然而本研究结果显示Gln对PCOS大鼠体内的睾酮、空腹血糖、胰岛素水平并没有改善作用，这可能与本研究Gln干预时间较短、样本量少相关。

综上所述，PCOS大鼠体内氧化与抗氧化失衡，氧化应激指标升高，抗氧化指标下降，给予Gln干预能显著降低MDA、NO、NOS水平、显著升高SOD水平，减轻PCOS大鼠体内氧化应激反应，为PCOS的治疗提供了新的途径。本研究的缺点在于Gln干预的时间较短、导致内分泌和代谢情况不能准确评价，并且对于Gln干预后的PCOS大鼠远期并发症情况没有检测相关指标，因此本课题组在后期的研究中会针对这些问题进行改进，以期获得更全面更准确的结果，为PCOS的治疗提供可靠的依据。