腐胺提高高龄小鼠卵母细胞质量及其机制的研究

胡梦婷，马薇薇，徐文丹，吴畏，严正杰，刘嘉茵，刘金勇,崔毓桂

(南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京 210029)

氧化应激是细胞衰老的共同机制之一。高龄女性卵母细胞质量下降、胚胎发育潜能差，其主要原因就是卵母细胞老化，即卵母细胞氧化应激水平升高、线粒体功能障碍。α硫辛酸、辅酶Q10、白藜芦醇和半胱氨酸等抗氧化剂能够降低细胞的氧化应激水平、改善线粒体功能，具有一定的延缓细胞老化的作用，但在卵母细胞的作用有待进一步研究[1-2]。因此，研究卵母细胞老化的机制和寻求新型抗氧化剂，对于改善高龄女性卵母细胞质量、提高妊娠率、改进辅助生殖技术临床结局具有潜在的意义。腐胺是细胞内由L-精氨酸合成的聚阳离子小分子化合物，鸟氨酸脱羧酶(ODC1)催化L-鸟氨酸脱羧生成腐胺，ODC1是多胺生物合成的限速酶，也是在多胺合成中真核生物酶。研究发现，细胞内腐胺参与控制细胞代谢过程中产生的自由基、抑制细胞膜脂质过氧化[3]，在细胞生长、增殖、分化、发育、免疫、迁移、基因调控、DNA稳定性以及蛋白质和核酸合成中发挥着重要作用[4]。腐胺在卵母细胞的作用如何？在本文研究腐胺是否通过抗氧化应激的机制提高体外培养的高龄卵母细胞的质量，以探讨其远期临床应用的价值。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物：7月龄C56/B6J雌鼠购于北京维通利华生物公司，饲养于南京医科大学动物中心至9月龄(相当于人类女性38～40岁年龄)。光照周期12 h/12 h；自由进食和饮水。本研究得到南京医科大学实验动物伦理委员会审批。

2. 实验试剂：鸟氨酸脱羧酶(ODC1)催化L-鸟氨酸脱羧生成腐胺，且 ODC1是多胺生物合成的限速酶[5]。α-二氟甲基鸟氨酸(α-difluoromethylornithine，DFMO，sigma公司，美国)是ODC1的特异性、高效抑制剂，可明显抑制细胞内多胺合成、显著降低多胺水平，已见于多项研究报道[3，5-6]。孕马血清促性腺激素(PMSG)(宁波舒生第二激素厂)。M2操作液、人表皮因子(hEGF)、重组人卵泡刺激素(rhFSH)[7-8]、透明质酸酶、腐胺、台式酸、矿物油、γ-actin抗体(sigma，美国)；兔抗大鼠SOD2多克隆抗体，兔抗大鼠SOD1多克隆抗体(proteintech，美国)；JC-1荧光探针(Molecular Probes，Eugene，Oregon，美国)；PVDF膜(GE Heahhcare，美国)；增强化学发光检测试剂盒(ECL detection kit，Millipore，美国)。

二、实验方法

1. 卵母细胞体外培养：9月龄C56/B6J雌鼠腹腔注射PMSG 10 U，48 h后断颈处死。立即取出卵巢，在显微镜下用1 ml无菌注射器戳破卵泡，用负压管虹吸卵丘细胞包裹完整的GV-COCs，平均置入IVM、0.5 mmol/L DFMO、0.5 mmol/L腐胺组中。采用微滴式培养，10枚GV-COCs置于一滴，每滴20 μl，覆盖2 ml矿物油以避免蒸发。在37℃、5%CO2、21%O2条件下培养16～18 h。

2. 卵母细胞收集：将培养后的COCs置于透明质酸酶中吹打，使包裹的卵丘细胞脱落。转移卵母细胞，置于M2微滴中，观察裸卵并计数完成第一次减数分裂及排出第一极体的卵母细胞(即MⅡ期卵母细胞)。

3. 单卵母细胞线粒体拷贝数：卵母细胞的选取及裂解：MⅡ期卵母细胞以台式酸酸化、吹吸，去除透明带，PBS液洗涤卵母细胞3次。制备终浓度为30 mmol/L Tris-HCL、5 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCL、体积分数 1.5% Tween-20及2 mg/ml 蛋白酶K的细胞裂解液，将卵母细胞移入装有10 μl 细胞裂解液的 0.2 ml PCR 管中；55℃加热2 h，95℃10 min，灭活蛋白酶K，裂解卵细胞。然后置于-80℃用于后续PCR扩增模板。

PCR模板制备及引物设计：根据相关文献，合成引物(由南京锐真生物技术有限公司合成)ND2 Forward 5’-CAC GAT CAA CTG AAG CAG CAA-3’，Reverse 5’-ACG ATG GCC AGG AGG ATA ATT-3’。

标准品制备：1 μl模板，10 μl SYBR Green PCR Master Mix，0.4 μl ROX Reference Dye，引物各0.8 μl，余下体积用双蒸水补齐至20 μl。反应条件为：95℃预变性5 min：95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；DNA提纯：扩增产物加入500 μl无水乙醇，4℃，12 000 rpm离心10 min，弃上清；加入500 μl 75%乙醇12 000 rpm离心10 min，弃上清，将提纯扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物分量，计算出分离纯化的DNA样品即标准品的拷贝数；将标准品按照 1∶10的比例进行等倍比稀释而形成梯度浓度标准品，标准品等比自稀释：10-3～10-8。

mtDNA 拷贝数检测：使用Quanti Nova SYBR Green PCR 试剂盒，在实时荧光定量PCR 扩增仪上检测mtDNA 拷贝数。根据试剂盒说明书制备20 μl PCR反应体系：1 μl模板，10 μl SYBR Green PCR Master Mix，0.4 μl ROX Reference Dye，上下游引物各0.8 μl，余下体积用双蒸水补齐至20 μl。反应条件为：95℃预变性5 min：95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；设定溶解曲线，检测 PCR 反应特异性。每次反应的标准曲线通过已知拷贝数的标准品确定，每个样品的起始mt DNA拷贝数通过此标准曲线来确定。

4. 氧化应激水平检测：检测高龄卵母细胞的ROS水平。使用50-羧基-20，7-二氟二氢荧光素二乙酸酯(carboxy-DFFDA；Molecular Probes)，一种能够检测强氧化剂如H2O2和过氧亚硝酸盐的荧光探针。将去除卵丘细胞的MⅡ期卵母细胞置入预热10 min的荧光探针微滴中，将培养皿放入培养箱中孵育30 min，然后在预热的M2操作液中洗涤3次，将其放置于预热的玻璃底培养皿中进行扫描拍摄。

5. 线粒体膜电位检测：膜电位敏感染料JC-1用于评估线粒体的功能活性。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。用DMSO制备2 mM JC-1储备溶液，保存于-20℃。使用前，将储备溶液用M2稀释至工作浓度2 μM。将工作液于培养皿中制成微滴，用矿物油覆盖防止工作浓度改变，置于培养箱中预热10 min。将卵母细胞置于微滴中放入培养箱孵育30 min，然后在M2操作液中洗涤3次，置入预热的玻璃底培养皿微滴中，后进行共聚焦观察。在相同的暴露强度下捕获所有卵母细胞。通过测量每个通道中整个卵母细胞的总荧光来进行荧光分析。使用校正的总细胞荧光(CTCF)方法将每个通道的平均灰度值标准化为测量区域。线粒体膜电位为总红色CTCF除以总绿色CTCF。

6. Western Bolting：收集30枚MⅡ期卵母细胞置于5 μl 蛋白裂解液中，与4～10% SDS-PAGE梯度胶电泳分离，转移到PVDF膜。用TBS(含5%脱脂奶)37℃处理l h后，加入SOD2抗体(1∶500稀释)或SOD1抗体(1∶500稀释)孵育，内参是兔抗鼠γ-actin多克隆抗体(1∶1 000稀释)，4℃过夜。TBST(TBS+0.1%Tween 20)洗脱后，二抗(驴抗兔IgG，1∶1 000稀释)37℃孵育1 h，TBST洗脱。用增强化学发光检测试剂盒(ECL)测定荧光强度。条带灰度值用天能凝胶成像系统软件(Tanon Gis Image system ID Danalysis，上海)分析。

三、统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。计数资料用均数±标准差表示，采用独立样本t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、腐胺增加高龄卵母细胞的成熟率

三组高龄卵母细胞成熟率比较(图1)。腐胺组卵母细胞成熟率(87.57±1.70)%，显著高于对照组(66.02±4.05)%，平均升高了22%(P<0.01)；DFMO组卵母细胞成熟率为(66.96±3.40)%，与对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。

二、腐胺减少高龄卵母细胞内活性氧

腐胺减少高龄卵母细胞内的活性氧(图2)。腐胺组卵母细胞内活性氧水平显著减少，DFMO组卵母细胞内活性氧水平显著升高(图2A)。与对照组(18 714 873±1 641 482)相比，腐胺组活性氧水平(11 827 188±1 290 525)下降了37%(P<0.01)；DFMO组(52 119 088±4 178 825)活性氧水平升高179%(P<0.01)(图2B)。

**P<0.01图1 腐胺提升高龄卵母细胞的成熟率

A、B、C：荧光显示卵母细胞内ROS,carboxy-DFFDA 绿色染料标记氧自由基,标尺50 μm;D：卵母细胞ROS水平统计分析,**P<0.01图2 腐胺减少高龄卵母细胞内ROS

三、腐胺提升高龄卵细胞内SOD1表达

腐胺提升高龄卵母细胞内SOD1蛋白的表达(图3A)。腐胺组卵母细胞内SOD1蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05)；DFMO组SOD1蛋白表达较对照组显著下降(P<0.05)(图3B)。

*P<0.05图3 腐胺提升高龄卵母细胞内SOD1蛋白表达

四、腐胺对高龄卵母细胞线粒体DNA拷贝数的影响

腐胺对高龄卵母细胞线粒体DNA拷贝数的影响(图4)。以DFMO抑制卵母细胞内腐胺生成，高龄卵母细胞线粒体DNA拷贝数(48 811±1 624)较对照组(35 026±6 402)增加24.4%(P<0.05)。但是，外源性添加腐胺，高龄卵母细胞线粒体DNA拷贝数(42 137±5 772)未发生显著改变(P>0.05)。

与对照组比较，*P<0.05图4 抑制腐胺增加高龄卵母细胞线粒体DNA拷贝数

五、腐胺提升高龄卵母细胞线粒体膜电位

线粒体内膜上的质子泵将线粒体基质内的质子泵出膜间腔，使内膜外电位为正、膜内为负，这种膜内外的电位差称为线粒体跨膜电位(△Ψm)，其阈值变化与氧化代谢水平相关，常被用来评估线粒体功能。当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光[9-10](图5A)。与对照组相比(0.62±0.05)，腐胺组线粒体膜电位(2.20±0.18)升高253%(P<0.01)，DFMO组(0.33±0.05)下降46.7%(P<0.01)(图5B)。

讨 论

卵巢卵母细胞和颗粒细胞内，腐胺可能参与调节卵母细胞发育成熟及排卵[5]。研究发现，在LH作用下卵巢组织ODC1升高，细胞内腐胺水平显著升高，激发卵母细胞成熟和随后的卵泡破裂以释放成熟卵；LH诱导卵巢ODC1活性比FSH的作用更有效，故认为腐胺对围排卵期的卵泡成熟是必要的[11-12]。有研究提示，高龄雌性小鼠卵巢内ODC1以及腐胺的浓度降低[11-14]。本文研究发现，在IVM培养液中添加腐胺有效提高高龄小鼠卵母细胞成熟率；添加DFMO以抑制ODC1，抑制内源性腐胺的生成，卵母细胞成熟率较腐胺组明显降低。与对照组比较，培养液中添加DFMO后高龄小鼠卵母细胞成熟率没有显著下降，表明高龄小鼠卵母细胞内ODC1活性低、腐胺浓度低，DFMO作用不明显。

线粒体是卵母细胞质中含量最为丰富的细胞器，其数量、结构和活性在卵母细胞发育成熟过程中发生显著变化，线粒体拷贝数由原始生殖细胞中不足10个逐渐增加到成熟卵母细胞的105个以上。线粒体产生的 ATP 是卵母细胞、受精卵以及早期胚胎发育的主要能量来源[15-18]。本研究发现，培养液中添加腐胺后高龄小鼠卵母细胞的线粒体拷贝数没有显著改变(P>0.05)；添加DFMO后，线粒体拷贝数增加，这可能是因为卵母细胞通过代偿性增加线粒体数量来平衡细胞内缺乏腐胺导致的线粒体功能不足。近年研究显示，线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件。卵母细胞线粒体膜电位与其胚胎发育潜能相关[25]。本研究发现，高龄小鼠卵母细胞体外培养液中添加腐胺，线粒体膜电位增加，提高其线粒体功能；DFMO的作用与之相反。说明腐胺提高卵母细胞线粒体膜电位、有效地改善线粒体功能。

A：高龄卵母细胞线粒体膜电位的观察,用JC-1染料检测线粒体膜电位，红色表示高线粒体膜电位,绿色表示低线粒体膜电位,标尺50 μm;B：卵母细胞线粒体膜电位统计分析;**P<0.01图5 腐胺提升高龄卵母细胞线粒体膜电位

出生前卵母细胞阻滞在第一次减数分裂前期的双线期，这一阶段称为生发泡(GV)。人GV期卵母细胞可在卵泡内停留40余年[19-20]。未成熟卵母细胞通过氧化磷酸化维持低水平的ATP，满足卵母细胞对能量的需求；而随着卵母细胞发育成熟，对能量需求大大增加。卵母细胞在氧化磷酸化产生ATP过程中，也产生副产物ROS。正常情况下，细胞内ROS和抗氧化之间维持动态平衡，使细胞内ROS保持一定的低水平。当线粒体功能不足，这种平衡被破坏，ROS升高，进而影响卵母细胞发育成熟、受精、胚胎发育[21-22]。有研究显示，高龄卵母细胞内ROS水平增加，胚胎发育潜能降低[21，23]。本研究发现，体外培养高龄卵母细胞时添加腐胺，显著减少细胞内ROS；而DFMO使ROS水平明显增加。在细菌以及细胞相关实验中，腐胺作为细胞内的抗氧化剂可以保护高氧化应激环境中的细菌和细胞[24]。卵母细胞的成熟依赖于活性氧与抗氧化之间的氧化还原平衡。哺乳动物细胞表达3种亚型的超氧化物歧化酶(SOD1-3)。本文实验中，腐胺并不影响卵母细胞内SOD2水平，与文献报道一致[26]。有文献报道，老龄小鼠卵巢内SOD1水平降低[27]；本研究发现，腐胺有效地提高卵母细胞内SOD1表达，DFMO抑制腐胺生成时明显减少SOD1表达，表明腐胺也能够有效地提高卵母细胞内SOD1表达，发挥抗氧化的作用，有助于达成卵母细胞内氧化-还原反应的平衡。

综上所述，腐胺通过改善线粒体功能、以及多重抗氧化的机制，促进卵母细胞成熟，提高高龄卵母细胞质量和胚胎发育潜能。我国目前放开了二胎政策，越来越多高龄女性有生育需求，但是高龄女性的生育结局较低[18，28]。与年龄相关的女性生育能力下降主要归因于卵巢衰老引起的卵母细胞质量下降[29]。本研究表明，腐胺改善高龄卵母细胞的质量，对改善高龄妇女的生育结局具有潜在的临床意义。