胚胎植入前遗传学诊断的临床应用分析

黄秋香，王志红，刘芸*，林春丽，陈智镖，黄吴键，毛丽华，何凌云

(福建医科大学福总临床医学院(第九○○医院)/厦门大学附属东方医院(第九○○医院)1.妇产科生殖中心；2. 实验科，福州 350025)

胚胎植入前遗传学诊断(PGD)技术是针对具有明确的致病基因或染色体异常携带者的夫妇进行促排卵，借助体外受精-胚胎移植技术对早期胚胎进行植入前活检和遗传学分析，将检测正常的胚胎植入子宫，从而获得健康胎儿的一种孕前诊断技术。Handyside等[1]首次成功应用PGD技术使一对有性连锁隐性遗传病的夫妇诞下健康女婴。此后PGD技术发展迅猛，结合人类辅助生殖技术的发展，帮助有遗传风险夫妇精准检测其胚胎实现优生优育，有效控制了出生缺陷。PGD目前主要应用于染色体异常和单基因遗传病两大类疾病的检测，虽然国内很多研究报道PGD能明显改善临床结局[2-4]，但大部分仅对某一遗传疾病进行研究，尚缺乏全面临床数据证实。因此本研究选取本中心136例PGD临床病例，按照不同临床适应证进行统计分析，为PGD技术的临床应用提供参考。

材料与方法

一、研究对象

选取2013年11月至2017年12月在本院生殖中心行PGD治疗的136对夫妇作为研究对象。所有夫妇均经过遗传咨询并签署PGD知情同意书。本PGD项目经卫生行政部门审批并经医院伦理委员会批准开展。

纳入标准：(1)染色体结构异常：包括相互易位、罗氏易位、倒位、复杂易位、致病性微缺失或微重复等；(2)染色体数目异常：包括47，XYY综合征、Turner综合征、克氏征等；(3)有遗传病家族史且已明确致病基因位点的常染色体显性、常染色体隐性、性连锁遗传的单基因遗传病夫妇。

二、方法

1. 胚胎体外受精、培养和活检：采用本中心常规方案进行控制性促排卵。取卵后4～6 h用卵胞浆内单精子显微注射受精，置于G1(Vitrolife，瑞典)微滴培养。取卵后D3观察卵裂情况，将卵裂胚胎[受精日观察原核(Pronucleus，PN)为2PN、0PN或1PN受精，不含多原核受精胚胎]转入含有G2(Vitrolife，瑞典)微滴进行囊胚培养。至D5/D6/D7，对可行活检胚胎参照文献[5]操作，取5～10个滋养层细胞。活检过的胚胎冷冻保存。

2. PGD步骤：PGD检测采用NGS技术。2013年11月至2017年08月期间，染色体病患者的活检细胞采用SurePlex法(SurePlex DNA Amplication Kit，Illumina，美国)进行全基因组扩增(WGA)，扩增产物使用Proton测序，检测胚胎23对染色体，包括父源或母源异常染色体，筛除非整倍体及拷贝数变异(CNVs)4 Mbp以上缺失或重复的胚胎；2017年09月至12月期间，1例染色体缺失患者和14例平衡易位患者的活检细胞采用多次退火环状循环扩增技术(MALBAC)进行WGA，扩增产物使用Hiseq2500(Illumina，美国)测序，检测范围同上述，且平衡易位患者的整倍体胚胎采用等位基因映射识别胚胎平衡易位携带状态技术(MaReCS)经单核苷酸多态性(SNP)连锁分析区分正常胚胎和易位携带胚胎[6]。

单基因病PGD中1例马凡综合征患者的活检细胞采用多重置换扩增(MDA)(REPLI-g Single Cell Kit，Qiagen，德国)进行WGA，扩增产物使用Proton测序，进行SNP连锁分析和突变位点序列分析；其他单基因病利用高通量测序技术同时进行突变位点和染色体异常以及连锁分析的新策略(MARSALA)[7]：患者的活检细胞先采用MALBAC法进行WGA，然后针对患者突变位点附近的SNP对WGA产物进行特异性PCR，再将PCR产物与WGA产物混合，以低测序深度进行NGS。

3. 胚胎移植与随访：根据PGD结果，择期选择正常胚胎进行移植。移植后14 d检测尿及血HCG，35 d后B超观察到妊娠囊，可确认为临床妊娠。妊娠18～23周行羊膜腔穿刺，抽取羊水进行产前诊断，并随访临床结局。

三、统计学分析

数据统计以SPSS 19.0版软件进行统计处理，组间比较用X2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PGD周期的临床资料

2013年11月至2017年12月共行PGD 136例，172个取卵周期，女方平均年龄(29.9±4.2)岁。136例中，染色体病116例，8个病种，占85.3%，其中2例嵌合体，核型分别为45，X[43]/46，XX，[57]和46，XX，t(11；22)(q23；q11.2)[70]/46，XX[30]；单基因病20例，8个病种，占14.7%(表1)。

表1 PGD周期临床资料(-±s)

二、PGD结果

全部采用囊胚期活检，136个PGD周期共成功活检474个胚胎：21个扩增失败(4.4%)，19个全基因组扩增后未行NGS检测(有3例患者由于活检胚胎数目较多，检测费用较高，故选择全部胚胎活检、全基因组扩增，数个胚胎行NGS检测)，明确诊断数434个，其中正常或携带者胚胎221个，异常胚胎213个，胚胎正常或携带者概率为50.9%。

染色体病PGD结果：共活检403个胚胎，明确诊断数367个，正常或易位携带胚胎175个，其中易位组有30个胚胎经SNP连锁分析区分出21个正常胚胎和9个易位携带胚胎。2例嵌合体患者的6个胚胎，染色体异常率达66.7%，可能是由于母源嵌合较高比例异常染色体所致。比较两种全基因组扩增方法，即Sureplex法和MALBACA法，扩增失败率无统计学意义(P>0.05)(表2)。

单基因病PGD结果：共活检71个胚胎，明确诊断数67个，其中马凡综合征患者的3个胚胎仅进行突变位点序列分析+SNP连锁分析，发现2个胚胎为正常基因胚胎。其余单基因病家系的64个胚胎进行MARSALA分析，发现有44个胚胎为正常基因型或表型正常的致病基因携带者且染色体正常(表3、4)。

表2 染色体病PGD结果 [n(%)]

注：与SurePlex扩增法比较，*P>0.05;#相互易位组24个胚胎被明确区分为正常和易位携带：17个为正常胚胎，7个为易位携带胚胎；罗氏易位组6个胚胎被明确区分为正常和易位携带：4个为正常胚胎，2个为易位携带胚胎

表3 隐性遗传病PGD结果[n(%)]

注：Chr：染色体

表4 显性遗传病PGD结果 [n(%)]

注：Chr：染色体；*马凡综合征组中有3个活检胚胎仅突变位点序列分析和SNP连锁分析，不列入统计

三、PGD临床妊娠结局

截止2018年9月30日，在136例PGD患者中，有12例患者无正常胚胎可移植，23例患者无囊胚形成，3例患者有正常胚胎但未解冻移植。

98例患者进行了115个周期的解冻移植，均为单囊胚移植，解冻后复苏率100%，76例获临床妊娠，临床妊娠率66.1%(76/115)，4例流产，流产率5.3%(4/76)，2例多胎妊娠，2例发生宫外孕，11例持续妊娠中，59例已成功分娩31个男婴和30个女婴，除1例单卵双胎分娩的2个男婴中有1个男婴肺动脉高压，肺泡发育欠佳，另1个男婴巨结肠外，其余婴儿均身体健康。

采用 MaReCS技术检测的患者解冻移植选择胚胎时，首选正常胚胎，其次易位携带胚胎。13例染色体易位PGD患者进行15个解冻移植周期，9例获临床妊娠，1例流产(表5)。

表5 PGD胚胎移植及临床结局 [n(%)]

注：*相互易位组中10例患者移植的11个胚胎：10个正常胚胎(5个临床妊娠)和1个易位携带胚胎(临床妊娠，该患者仅1个正常胚胎，第一次移植未获妊娠，此为第二次移植)；*罗氏易位组中3例患者移植的4个胚胎：3个正常胚胎(2个临床妊娠，1个流产)和1个易位携带胚胎(临床妊娠，该患者无正常胚胎可移植)

讨 论

2015年欧洲人类生殖与胚胎学学会(ESHRE)报道了62个中心5 780个取卵周期的数据：2 979个胚胎植入前遗传学筛查(PGS)周期，1 574个单基因疾病周期，1 071个染色体异常周期，108个X染色体连锁疾病周期，48个社会性别选择周期[8]。在本文统计中PGD患者以染色体异常居多，占85.3%(116/136)，染色体易位在其中占77.6%(90/116)，为最常见的染色体异常。克氏征、47，XYY和染色体倒位等病例在开展PGD治疗初期列入PGD范围，后根据胚胎检测结果及文献复习，我们认为这部分病例采用常规体外受精即可或者若有不良孕产史者可行PGS治疗，故2017年后就将克氏征、47，XYY和染色体倒位剔出PGD适应证。PGD治疗的单基因病有8个病种，地中海贫血最多，达65.0%(13/20)，可能与我中心地处地中海高发地域有关，同时也显示出我们检测单基因病的病种和周期数明显少于文献报道的数据，分析其原因可能为：(1)本中心开展PGD工作量并不大，所诊疗的患者中单基因病病种不够多，需积累更多病例观察；(2)单基因病的诊断技术仍需改善，待开拓更多的可诊断病种和方法。

鉴于对卵裂期活检局限性的研究报道[9-11]，以及受益于胚胎序贯培养至囊胚阶段的成功、胚胎玻璃化冷冻技术的开展，囊胚滋养外胚层细胞活检受到广泛运用，故本文全部采用囊胚期活检，以获得足够数量的细胞保证足够的扩增产物进行检测，且保障了胚胎的安全。

本文采用具有高通量、低成本、耗时少等优点的NGS技术进行PGD。染色体疾病不再传统地仅针对亲代异常的染色体进行检测，而是全面检测23对染色体，目前更进步到利用MaReCS技术判断胚胎的染色体易位携带状态，成功地将30个胚胎区分为21个正常胚胎和9个易位携带胚胎，达到阻断平衡易位向子代的传递。同时比较了两种WGA方法的扩增失败率，因为WGA是NGS关键一步，其扩增的均一性和保真度是精确测定拷贝数变异和单核苷酸变异的前提条件，结果表明Sureplex法和MALBAC法在扩增失败率上无统计学差异(P>0.05)，可应用于胚胎整倍性的NGS-PGD检测，与Li等[12]研究报道一致。单基因病从最初突变位点序列分析结合STR连锁分析，发展到一套完整的MARSALA技术，即突变位点序列分析+SNP单体型分析+染色体非整倍体分析，将单基因病家系PGD治疗时女方年龄因素可影响胚胎染色体异常风险[13]因素考虑进去，大大提升了PGD的准确性和全面性，为选择健康胚胎移植提供了有力保障。可见，基于NGS技术的PGD可精准检测出染色体异常和致病基因突变，对于获取正常胚胎、阻断遗传病传播、避免出生缺陷意义重大。

常规PGD治疗后需要进行孕期产前诊断，单胚胎移植可以避免双胎或多胎妊娠造成产前诊断困难等不足，而且单囊胚移植在降低多胎妊娠率的同时仍能保持较高的临床妊娠率[14-15]。故本文PGD患者均选择单囊胚解冻移植，其临床结局亦证实这点，临床妊娠率66.1%，

多胎妊娠率2.6%，PGD治疗后所有孕中期产前诊断结果与PGD结果一致，共出生31个男婴和30个女婴，结果令人满意。值得一提的是，采用 MaReCS技术检测，13例染色体易位PGD患者解冻移植13个正常胚胎和2个易位携带胚胎，分别有7个和2个获临床妊娠。截止2018年9月30日，有4个正常胚胎和1个易位携带胚胎移植后孕中期羊水诊断核型分析确认结果与MaReCS结果一致，1个正常胚胎移植后流产，绒毛NGS检测验证确认结果亦与MaReCS结果一致。可见，MaReCS技术有望为染色体易位患者家庭改写生育结局。