绿茶提取物EGCG对乙醇诱导大鼠学习记忆功能障碍的作用

杨海玉 刘勇 胡建新 戴艳枝 文丽丹

作者单位：330006 南昌，江西省人民医院临床医学研究所(杨海玉、文丽丹)、病理科(刘勇、戴艳枝)、药剂科(胡建新)

大脑是乙醇(俗称“酒精”)诱导损伤的最常见靶器官之一，长期大量饮酒可引起脑器质性损害，并逐渐发展至痴呆状态，称之为乙醇性痴呆(alcohol-associated dementia，AAD)，临床以学习记忆功能受损为其主要特征表现，严重者日常生活不能自理[1]。目前研究认为乙醇对学习记忆的影响并不是作用于整个大脑，而是针对某些特定脑区，尤其是海马结构[2]。海马是与学习记忆功能密切相关的重要脑区，研究证实乙醇可通过诱导氧化应激和神经炎性反应等途径导致神经细胞发生凋亡，致使海马区功能性神经细胞数目减少，从而导致学习记忆功能障碍[3-4]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是从绿茶中分离得到的儿茶素类单体，也是绿茶的主要活性成份。大量研究证实EGCG具有非常强的抗氧化活性，可抑制各种诱因导致的神经元凋亡，对中枢神经系统具有保护作用[5-7]。另外，我们的前期工作也证实EGCG对乙醇诱导的SH-SY5Y神经元细胞损伤具有保护作用[8]。本研究通过建立AAD大鼠模型，以Morris水迷宫行为学检测评价其学习记忆功能，并进一步观察大鼠海马组织形态学和细胞凋亡改变，初步探讨EGCG对乙醇诱导学习记忆功能障碍的作用及机制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物：6～8周龄雄性SD大鼠(180～220 g)，购自江西中医药大学实验动物部。

1.1.2主要试剂和仪器：EGCG购自成都曼思特生物科技有限公司，水合氯醛由江西省人民医院药剂科提供；Hoechst33342染色剂购自碧云天生物技术研究所，氧化应激检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；荧光实时定量PCR相关试剂购自美国Thermo Fisher公司。水迷宫设施由安徽正华生物仪器设备有限公司提供。

1.2方法

1.2.1实验动物与处理：实验设对照组和EGCG组(n=15)，两组动物均按体质量8 mL/(kg·d)给予20%(体积分数)乙醇灌胃持续28 d，建立AAD大鼠模型[9]。EGCG组在乙醇灌胃前1个月起给予EGCG(1 mg/mL)自由饮水至乙醇灌胃结束，对照组给予蒸馏水代替。

1.2.2Morris水迷宫行为学检测[10]：各组大鼠在开始乙醇灌胃前和乙醇灌胃28 d后分别进行Morris水迷宫行为学检测。水迷宫设施为直径150 cm圆形游泳池，划分为四个象限，于第四象限中央放置一15 cm×10 cm×20 cm平台，泳池内灌水以没过平台1～2 cm为宜。检测动物从入水至寻找到平台的时间，即逃避潜伏期(escape latent，EL)，并以此作为衡量动物学习记忆能力的主要指标。由于平台放置在第四象限，以第四象限路程/总路程百分比和第四象限时间/总时间百分比作为评价学习记忆能力的参考指标。上述实验结束后撤去水下平台，然后任选同一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，计算其在60 s内跨过平台相应位置的次数(穿台次数)，用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的保持能力。

1.2.3大鼠海马组织形态观察及神经细胞凋亡检测：Morris水迷宫行为学检测结束后，各组取3只大鼠给予10 %(体积分数)水合氯醛腹腔注射麻醉，经40 g/L多聚甲醛灌流后取全脑并以40 g/L多聚甲醛固定24 h，选取海马部位切取厚度为2 mm脑片，经脱水、透明、石蜡包埋，制作厚约4～6 μm的组织切片。

(1)大鼠海马组织形态观察：将切片进行常规苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，光镜下观察海马组织形态学改变并取图。

(2)大鼠海马神经细胞凋亡检测：海马区组织切片经脱蜡、水化处理后用PBS洗3次，然后每张切片滴加适量Hoechst33342染色液覆盖组织，避光染色10 min，PBS洗3次后封片，采用荧光显微镜观察取图。每只大鼠选取1张切片，在每张切片双侧海马齿状回随机选取3个视野，并进行凋亡细胞计数。凋亡细胞的特征表现为细胞核呈明显固缩、浓染。

1.2.4大鼠海马组织凋亡相关因子表达：本研究采用荧光实时定量PCR技术检测凋亡因子B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2， BCL2)、BCL2-相关X蛋白(BCL2-associated X， BAX)基因在大鼠海马组织中的表达变化(n=6)。引物序列设计如下：BCL2上游引物5′-GTACCTGAACCGGCATCTG-3′，下游引物5′-GGGGCCATATAGTTCCACAA-3′； BAX上游引物5′-GTGAGCGGCTGCTTGTCT-3′，下游引物5′-GTGGGGGTCCCGAAGTAG-3′；内参GAPDH上游引物5′-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3′，下游引物5′-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3′。RNA提取后按试剂盒说明书进行逆转录反应，之后采用荧光定量PCR仪(美国ABI Step one plus Real time-PCR system)进行PCR反应，反应步骤为：95°C变性15 s，60°C退火20 s，72°C延伸40 s，共40个循环；实验数据采用2-ΔΔCT的统计学方法处理，计算过程如下：△CT目的基因=CT目的基因-CT同一样本的内参基因，△△CT目的基因=△CT实验组目的基因-△CT对照组目的基因，相对倍数(实验组/对照组)=2-ΔΔCT目的基因，所得结果为BCL2及BAX的相对表达量(即检测目的基因相对于内参基因的表达变化)。

1.2.5大鼠海马组织氧化应激相关酶活性检测：各组大鼠断头处死(n=6)，分离新鲜海马组织匀浆，之后4℃、3000 r/min离心10 min，提取上清液-80℃冻存备用。实验方法按总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒说明书进行。采用紫外分光光度计分别检测T-SOD反应液和GSH-Px反应液(450 nm)的吸光度〔D(λ)〕值，并根据标准曲线方程计算反应液中的产物浓度；吸光度值越大，提示抗氧化酶活性越高。

1.3统计学处理采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示。两组间均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Morris水迷宫行为学检测结果

如表1所示，对照组大鼠在乙醇灌胃后其EL时间明显延长(t=2.474，P=0.035)、第四象限时间/总时间百分比(t=5.202，P=0.001)、第四象限路程/总路程百分比明显下降(t=3.374，P=0.008)，提示其学习记忆功能在一定程度上受到乙醇损害。EGCG组大鼠的EL时间、第四象限时间/总时间及第四象限路程/总路程百分比在乙醇灌胃前后均无明显改变(P>0.05)；并且与对照组相比，EGCG组大鼠在乙醇灌胃后其EL时间缩短、穿台次数增加、第四象限路程/总路程百分比及第四象限时间/总时间百分比增高(均P<0.05)，提示其学习记忆功能损害得到明显改善。

2.2大鼠海马HE染色观察结果对照组大鼠海马区可见大量散在分布的异常细胞，胞核固缩变形、浓染，细胞密度减少(图1A)；EGCG组大鼠海马区细胞结构清晰、完整，形态均一，细胞核未见异形、浓染等明显异常改变(图1B)。

2.3两组大鼠海马神经细胞凋亡情况比较对照组大鼠海马区(图2A)可见大量聚集分布的致密浓染凋亡细胞；而EGCG组大鼠海马区仅见少量的浓染凋亡细胞(图2B)。凋亡细胞计数结果显示，与对照组比较，EGCG组大鼠海马区的凋亡细胞数量明显减少(P<0.05；表2)。

表1 两组大鼠Morris水迷宫行为学检测结果

注：与灌胃前相比，aP<0.05，aaP<0.01

注：A：对照组；B：EGCG组 图1 两组大鼠海马区组织形态比较(HE×200) 注：A：对照组；B：EGCG组 图2 大鼠海马区凋亡染色结果(Hoechst33342免疫荧光×200)

表2 两组大鼠海马组织凋亡细胞、凋亡相关因子及氧化应激相关酶活性比较

2.4两组大鼠海马组织凋亡相关因子表达及氧化应激相关酶活性比较荧光实时定量PCR实验结果显示，与对照组比较，EGCG组大鼠海马组织中抗凋亡因子BCL2的表达明显增高，促凋亡因子BAX的表达明显降低(均P<0.05)。与对照组比较，EGCG组大鼠海马组织中抗氧化酶T-SOD、GSH-Px的酶活性均明显增高(均P<0.05)。具体结果见表2。

3 讨论

随着社会生活方式的改变，饮酒已成为人们交际生活中越来越多的行为，由此带来的健康问题亦受到越来越多的关注。AAD是慢性乙醇中毒最为严重的精神病状态，也是长期大量饮酒引起脑器质性损害的结果，临床表现记忆力缺损伴其他认知功能障碍为其主要特征。海马是神经元高度集中的部位，现有研究认为海马是调控学习记忆功能的关键脑区，在短时记忆转为长时记忆以及空间航行定位功能中具有重要作用。目前已有大量研究证实长期慢性饮酒可促使海马体积减小及海马区大量神经细胞凋亡。Oliveira-da-Silva等[3]对出生后30～45 d的C57BL/6小鼠给予腹腔注射乙醇发现，乙醇作用可导致海马大部分区域(包括齿状回颗粒层及分子层、CA1、CA2和CA3区)的凋亡细胞数目增加，而且神经元及胶质细胞密度明显减少。本研究也同样证实，28d乙醇灌胃可导致大鼠学习记忆功能损害，并明显破坏其海马组织结构及诱导海马神经细胞发生显著凋亡。上述结果提示乙醇促进海马神经元凋亡是其导致学习记忆功能损伤的重要机制。

然而，目前对于慢性乙醇中毒导致的学习记忆功能障碍尚无有效的治疗方法，主要是在戒酒治疗同时予以B族维生素、胞二磷胆碱等神经营养剂作为支持，而其治疗效果并不理想。EGCG是从绿茶中分离得到的儿茶素类单体，它是绿茶主要的活性成份，在儿茶素中含量最高。早在古代医书中就有关于茶叶解酒毒功效的记载。现代研究证实EGCG具有非常强的抗氧化活性，不仅对中枢神经系统损伤具有保护作用，而且可明显改善动物学习认知功能[5-7]。更为重要的是，有研究证实EGCG可明显促进成年动物海马神经干细胞增殖和神经元存活，并且可促使神经干细胞向损伤区域迁移[11-13]。因此，本研究以AAD大鼠模型为实验对象，初步探讨绿茶提取物EGCG对酒精诱导学习记忆功能障碍的作用及机制。本研究结果表明，EGCG可明显改善AAD大鼠的学习记忆功能，并可在一定程度上减轻乙醇导致的海马形态结构破坏。本研究还观察到，EGCG作用可明显减少AAD大鼠海马区的凋亡细胞数目，同时可上调抗凋亡因子BCL2表达及下调促凋亡因子BAX的表达，由此可见EGCG可通过抑制海马神经细胞凋亡信号通路而发挥保护作用。另外，EGCG作用可增强大鼠海马组织中抗氧化酶T-SOD和GSH-Px的酶活性，提示其也可通过抗氧化应激而发挥对乙醇诱导海马损伤的保护作用。

综上所述，本研究结果提示EGCG对于乙醇诱导的学习记忆功能损伤具有一定的改善作用，其机制可能与抑制海马神经元凋亡和抗氧化应激有关。由此可见EGCG对AAD临床治疗可能具有潜在的价值。