绞股蓝皂苷XLIX的研究概况

2019-04-17胡晓安胡萌萌马鹏飞

中国医药科学 2019年6期

胡晓安胡萌萌吴晗马鹏飞张莉

1.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西西安 710061；2.西安京西双鹤药业有限公司，陕西西安 710061;3.陕西省中医医院，陕西西安 710065

绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino，又名七叶胆、遍地生根、公罗锅底、小苦药、五叶参、日本名甘茶蔓[1]等，是葫芦科绞股蓝属多年生攀援草质藤本植物[2]。味甘、苦，性寒，归肺、脾、肾经。绞股蓝中含有皂苷、多糖、黄酮、甾醇类、氨基酸及微量元素等多种化学成分[3-5]。目前普遍认为皂苷、黄酮等是其主要活性成分，已知含有包括绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX 等140余种绞股蓝皂苷以及商陆素、芦丁、槲皮素等10余种黄酮类成分[6]，是目前所知非五加科人参属植物中唯一含有人参皂苷类成分的植物[3]。该属植物基源复杂、品种繁多，全世界已知绞股蓝属植物有17种、2变种，我国有14种、2变种[7]，其中9种、2变种为我国特有种。绞股蓝多分布于亚热带和北亚热带地区，我国主要分布于秦岭和长江以南地区[8]，其中陕西安康的平利县、宁陕县盛产绞股蓝，因此平利被列为中国绞股蓝原产地。

绞股蓝总苷（gypenoside）是以绞股蓝为原料经提取分离制成的总苷原料药，其药品制剂有绞股蓝总苷片[9]、绞股蓝总苷胶囊[10]等，临床功能主治养心健脾，益气和血，除痰化瘀，降血脂。用于高血脂症，见有心悸气短，胸闷肢麻，眩晕头痛，健忘耳鸣，自汗乏力或脘腹胀满等心脾气虚，痰阻血瘀者[11-12]。

在绞股蓝的皂苷类、黄酮类、多糖类、维生素、氨基酸等多种生理活性物质中，其中皂苷类是其主要活性成分[13]，日本学者家竹本常松于1983年在绞股蓝中发现绞股蓝皂苷XLIX（CAS号：94987-08-3），并对其进行结构鉴定和确证[14]。药理学研究表明，绞股蓝皂苷XLIX具有抑制肿瘤生长、保护心脑血管系统、降低血糖、调节血脂平衡、减少氧化应激等作用[15-19，31]。其含量在绞股蓝总苷中高达6%～20%，为其中含量最高的活性特征成分之一[19]，且专属性强，目前尚未发现在其他科属植物中该组分的报道。

1 绞股蓝皂苷XLIX的提取与纯化[6，20]

绞股蓝总皂苷原料提取纯化用正相硅胶短柱，首先用乙醇洗脱，再用氯仿、乙酸乙酯、甲醇组成的流动相采用极性增加的梯度进行洗脱，分别收集得到10个馏分（A-J），评价其对VCAM-1的抑制活性，经重新分级后产生6个级分（J-1～6）。将包含绞股蓝皂苷XLIX级分的J-6使用制备液相进一步纯化，色谱条件：制备柱C18，用33%乙腈水洗脱液等度洗脱，检测波长206nm。经纯化的绞股蓝皂苷XLIX含量可达到98%以上。

2 绞股蓝皂苷XLIX的结构鉴定和确证

绞股蓝皂苷XLIX属达玛烷型四环三萜皂苷[3]。其分子结构特点是分子中C8位有β构型的角甲基。C13位有β氢，C10位有β醛基，C14位有α甲基，C17位有β侧链，C20位为S构型，苷元的C3位连有鼠李糖、木糖和阿拉伯糖构成的糖链，C20位连有葡萄糖。根据13C-NMR，DEPT，MS 及元素分析确定分子式为C52H86O21，分子量为1047.23，Liebermann反应阳性。IR：在3418cm-1，1044cm-1处有强的羟基吸收；在1701cm-1处有一羰基吸收峰；1379cm-1，1260cm-1处有四环三萜的特征吸收峰。其乙酰化物的IR谱无羟基吸收。1H-NMR谱在δ 5.02ppm（1H，d，J=7.89 Hz）处多一个质子信号，归属于葡萄糖的端基质子。13C-NMR谱中C21δ 66.87ppm向低场位移至76.36ppm，说明分子中C21羟基与糖结合成苷。δ46.13，76.31及36.70ppm各信号分别归属于C17，C20及C22。受C21羟基苷化的影响，各碳原子分别位移-0.06，-0.20和+0.05ppm，多出一组葡萄糖信号，分别为δ106.25，75.54，78.65，71.82，78.71和62.93ppm。经综合解析，确定其结构见图1。

图1 绞股蓝皂苷XLIX结构式

3 绞股蓝皂苷的药理作用

绞股蓝中含有多种皂苷、黄酮、氨基酸以及多糖等活性成分，自1976年日本学者从绞股蓝中分离出达玛烷型皂苷以来，各国学者已经从绞股蓝中提取得到了上百种绞股蓝皂苷[21-23]，并一直研究其药理作用。目前已经证实绞股蓝皂苷具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗阿尔茨海默病、抗焦虑、抗衰老、镇静催眠、降血糖以及免疫调节等作用[15-18]，其中养心健脾、益气活血、除痰化瘀、降血脂作为明确疗效写入了绞股蓝总皂苷说明书中。

3.1 调节血脂、抗动脉粥样硬化

绞股蓝皂苷可有效预防和治疗高脂血症以及动脉粥样硬化，这种调节血脂的作用与抑制脂肪细胞产生游离脂肪酸及促进合成中性脂肪有关[21，23]。绞股蓝皂苷能够不同程度地降低高脂动物血清中的总胆固醇（TC），甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）浓度，显著增加血液中的高密度脂蛋白（HDL），并且可显著降低内皮素（ET），从而降低动脉粥样硬化的发病率，在预防和治疗心脑血管疾病新药研发方面具有开发价值[8，25]。

3.2 抗肿瘤作用

绞股蓝皂苷具有显著的体内外抗肿瘤作用[8]，研究表明其可以明显抑制体外培养结肠癌细胞、肿瘤细胞、肾上腺皮质癌细胞以及人急性白血病细胞增殖，同时对正常细胞增殖无不良影响[8]。在小鼠结肠癌模型中用绞股蓝总皂苷连续给药出现显著疗效，与5-氟尿嘧啶协同化疗时疗效显著；绞股蓝总皂苷在体外能有效抑制人的肾上腺皮质癌细胞（ACC SW-13）的增殖，其机制可能与上调caspase-8 m RNA的表达相关[26]。绞股蓝总皂苷可改变人急性白血病细胞（HL-60）的形态，降低细胞活性，诱导G0/G1期细胞停滞，使DNA破碎，并促使HL-60细胞凋亡[27]。

3.3 抗阿尔兹海默病

阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。姚柏春等[24]探讨了绞股蓝皂苷（GPM）改善痴呆小鼠学习记忆能力的作用及机制，绞股蓝皂苷能对抗自由基的氧化损伤、修复线粒体的超微结构进而改善SDAT鼠的认知能力，其机制可能与其减轻脑组织抗氧化损伤、减少Aβ表达有关[24]。本研究有希望用于人类老年痴呆症疾病的治疗，为绞股蓝资源的开发利用提供依据。

3.4 降血糖作用

糖尿病已成为世界第3大慢性疾病，研究表明绞股蓝降血糖作用的主要成分是皂苷与多糖。近年发现其作用机制可能与激活Nrf2信号通路有关[23]。研究发现，绞股蓝内生真菌JY25多糖对α-葡萄糖苷酶有竞争性抑制作用，与糖尿病临床防治药物阿卡波糖的抑制类型相同，具有开发成新型降血糖药物和保健品的潜能[23]。

3.5 抗衰老作用

研究发现，绞股蓝提取液的抗衰老作用主要通过增强血液超氧化物歧化酶（SOD）活性，同时降低自由基活性而实现的[28]。绞股蓝皂苷能阻止脂质过氧化，减少Ca2+内流，明显抑制谷氨酸盐下调Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白表达，进而降低谷氨酸引起的细胞凋亡[29]；绞股蓝皂苷还可以通过减少细胞内过氧化物的堆积，降低谷胱甘肽（GSH）的消耗，增加细胞内GSH 含量[8]。

3.6 镇静催眠作用

江砚等[30]研究发现绞股蓝总皂苷具有明显的镇静、催眠作用，能显著延长阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间[8]。GABA对哺乳动物中枢神经系统具有普遍的抑制作用，研究显示其可通过介导褪黑素促进睡眠。绞股蓝总皂苷不仅可显著降低大鼠下丘脑内DA、NE含量，还可使IL-lβ含量增高[23，30]。

3.7 抗焦虑作用

绞股蓝总皂苷连续给药可恢复由慢性足底电击应激导致的小鼠大脑内DA和5-羟色胺水平降低情况，并且可调节c-Fos蛋白的表达水平和肾上腺皮质的水平，改善小鼠的焦虑症状[23]。

3.8 免疫调节作用

绞股蓝中发挥免疫调节作用的主要成分是皂苷与多糖[23]。研究表明，绞股蓝总皂苷连续用药可增强正常小鼠淋巴细胞的增殖，可显著增强巨噬细胞的吞噬功能，提高免疫器官指数，提高小鼠血清溶血素含量，对细胞免疫和体液免疫都有增强的作用。能提高正常机体非特异性免疫能力[22-23]。

绞股蓝其良好的临床疗效已经在长期、大量实践中得到证明，近年来，以绞股蓝为主研发的保健食品层出不穷，而以绞股蓝总皂苷涉及的药品剂型也是丰富多样，包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、软胶囊剂、颗粒剂等，几乎涵盖了所有口服剂型。另外绞股蓝总皂苷由于其确切的降脂作用，写入了相关制剂的说明书中，与化学降脂药品相比较，其无明显副作用，且在降脂的同时，能明显控制血糖升高与减少糖尿病作用。

4 绞股蓝皂苷XLIX的药效机制研究

从20世纪80年代起，有关绞股蓝及提取物总苷的药理研究报导甚多，充分证明了其具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗阿尔茨海默病、抗焦虑、抗衰老、镇静催眠、降血糖以及免疫调节等作用[15-18]，并在长期的临床应用中证明了其确切疗效，未见不良反应的报导，但绝大部分是对绞股蓝总苷原料药及制剂的药理研究，而对有效单体成分的药理活性和作用机制缺乏深层次的研究。绞股蓝皂苷XLIX是绞股蓝中的主要活性成分之一，Huang等[31]在2007年对绞股蓝皂苷XLIX分子的抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化作用机制进行了深入研究，结果表明绞股蓝皂苷XLIX是一种天然的选择性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-α激活剂，其活性类似于Wy-14643，通过PPAR-α途径产生抗炎，抗癌和抗动脉粥样硬化作用的机制有以下六点。

4.1 抑制核因子-κB的激活[31-32]

核因子-κB（NF-κB）体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递，在炎症的产生中起重要作用。在Huang等[31]的研究报告中进一步证明了绞股蓝皂苷XLIX作为过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）-α激活剂，除了能够调节脂质代谢外，还能减少NF-κB活化，终止炎症通路的激活。通过研究绞股蓝皂苷XLIX（Gyp-XLIX）对细胞系中内毒素（LPS-）和肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导的I-κBα抑制和NF-κB活化的影响。以PDTC为吡咯烷二硫代氨基甲酸作为阳性对照，结果显示阳性对照PTDC完全抑制了由LPS诱发的RAW 264.7巨噬细胞中NF-κB启动子的活化，绞股蓝皂苷（GP）提取物和Gyp-XLIX也有效地抑制了NF-κB启动子活性[32]。

4.2 抑制细胞因子对于人内皮细胞表达血管粘附因子-1 （VCAM-1）的诱导作用[32]

血管细胞粘附因子-1（VCAM-1）涉及多种疾病，其中包括慢性炎症和动脉粥样硬化。抗炎，抗癌和抗动脉粥样硬化药物的一个关键目标就是要抑制这种粘附因子的表达式。在使用VCAM-1特异性单克隆小鼠抗体进行酶免疫测定的结果显示，绞股蓝皂苷XLIX抑制了人工培养的人脐静脉内皮细胞中细胞表面VCAM-1的诱发。抑制VCAM-1活性是治疗一些炎症和心血管疾病（包括动脉粥样硬化）的重要机制之一。

在研究中进一步证实了绞股蓝皂苷XLIX通过PPAR-α途径抑制VCAM-1活性。与对Wy-14643的作用相似，特异性PPAR-α抑制剂MK-886作用完全相反，绞股蓝皂苷XLIX对TNF-α刺激的VCAM-1荧光素酶活性的增加起到抑制作用。

4.3 抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞表达VCAM-1mRNA的作用[33]

研究者在对人脐静脉内皮细胞中TNF-α（炎症介质）诱发的VCAM-1核糖核酸和蛋白表达式影响的实验中，将细胞用Wy-14643，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，绞股蓝皂苷XLIX或载体（0.1%二甲基亚砜）预处理30min。再用TNF-α刺激5h，处理后，收集核糖核酸和蛋白质，并分别通过逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法进行分析。结果显示，TNF-α诱发的VCAM-1核糖核酸和蛋白质超约3倍表达，可以由吡咯烷二硫代氨基甲酸酯完全抑制，绞股蓝皂苷XLIX浓度依赖性地降低TNF-α诱发的VCAM-1核糖核酸和蛋白质表达式的程度，可达到相同浓度下与正控制Wy-14643相当的程度。

4.4 抑制LPS诱导THP-1单核细胞表达组织因子的作用[34]

研究报告显示，用不同浓度的绞股蓝皂苷XLIX预处理单核细胞THP-1一定时间后，分别用RT-PCR检测由细菌脂多糖（LPS）诱导的THP-1单核细胞TF mRNA和蛋白质表达水平。结果显示：绞股蓝皂苷XLIX减少了LPS诱导的人单核细胞TF mRNA和蛋白质的表达。表明绞股蓝皂苷XLIX抑制LPS诱导THP-1单核细胞表达组织因子的表达，此机制证明绞股蓝皂苷XLIX是一种PPAR-α激动剂，起到了抗动脉粥样硬化作用。

4.5 调节游离脂肪酸代谢的作用[34]

研究表明，游离脂肪酸可通过抑制葡萄糖跨膜转运、影响胰岛素信号转导、引起胰岛细胞凋亡等多条途径而引起胰岛素抵抗。由于PPAR-α在调节脂肪代谢中起重要作用，PPAR-α激动剂可以降低血浆中游离脂肪酸的水平，达到改善胰岛素抵抗、降低糖尿病发病率的目的[35-37]。绞股蓝皂苷XLIX作为一种天然的PPAR -α激动剂，抑制了脂多糖诱导的THP-1在人单核细胞中的表达及活性。

4.6 改善糖尿病肾小球功能[38]

糖尿病肾病（DN）的发病率在逐年上升，其发病机制复杂，至今尚未明确[36]。赵璐等[38]对绞股蓝皂苷XLIX改善糖尿病大鼠肾小球功能的作用机制进行了研究，经绞股蓝皂苷XLIX治疗的大鼠的尿蛋白含量、GFR、肾小球细胞凋亡比例明显降低，而高密度脂蛋白（HDL）含量上升。模型组大鼠肾小球组织中Bcl-2蛋白表达下调而Bax蛋白表达上调、VCAM-1表达上升，绞股蓝皂苷XLIX治疗则可逆转这些变化。绞股蓝皂苷XLIX抑制模型大鼠肾小球细胞凋亡的试验结果表明，降低了肾小球阳性细胞比例。绞股蓝皂苷XLIX对肾小球组织蛋白表达的影响试验结果表明，与正常组比较，模型组肾小球组织中Bcl-2蛋白表达降低，而Bax、VCAM-1蛋白表达升高。与模型组比较，中、高剂量绞股蓝皂苷 XLIX 促进肾小球组织中Bcl-2蛋白表达，而抑制Bax、VCAM-1 蛋白的表达。以上研究可得出：绞股蓝皂苷XLIX可降低糖尿病大鼠血糖、血脂水平，改善肾小球功能并通过PPAR-α调控VCAM-1的表达。

以上的研究结果表明，绞股蓝皂苷XLIX治疗动脉粥样硬化、炎症、心血管疾病以及糖尿病、肾病的作用机制是通过PPAR-α依赖途径，抑制细胞因子诱导的VCAM-1过度表达式和人类内皮细胞的活性[38]。为今后开发利用绞股蓝皂苷XLIX治疗多种疾病提供了科学依据。