基于网络药理学探讨芎芍胶囊抗动脉粥样硬化的作用机制

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活血化瘀是中医治疗动脉粥样硬化(AS)的有效治法，针对炎症反应的“毒”认识，解毒活血法治疗动脉粥样硬化易损斑块疗效确切[1]。国家“八五”攻关期间，实验和临床研究均证明活血化瘀药血府逐瘀浓缩丸有明确抗动脉粥样硬化疗效，其后逐渐精简选择方中两味主药川芎、赤芍，临床研究显示在西药常规治疗基础上加用芎芍胶囊，对经皮冠状动脉介入(PCI)术后再狭窄可以起到较好的防治作用[2]。方中川芎辛温而燥，善于行走，能化瘀滞，开血郁，上行头目，下达血海，为血中气药；赤芍通利血脉，其性偏凉，可制川芎温燥之性。川芎与赤芍，性虽有寒热之殊，而功有行血破滞之同，两药合用可发挥协同作用，使机体气血运行正常，营卫生化有度。实验研究发现其能够抗血小板黏附聚集，降脂，抑制平滑肌细胞增殖，预防血管重构从而延缓动脉粥样硬化进展[3-5]。在“活血化瘀药(芎芍胶囊)促进动脉粥样硬化血管平滑肌细胞胆固醇跨膜转运的机制研究”(国家自然科学基金，编号81173385)中发现活血化瘀药(芎芍胶囊)在不影响脂蛋白水平的情况下能够促进胆固醇跨膜转运，升高协同其他相关蛋白参与胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)全过程的肝X受体蛋白表达量，促进胆固醇转出，降低髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平，抗动脉粥样硬化作用确切，但其分子机制尚不清楚。

BATMAN-TCM分析体系基于TCMID数据库中药方-草药-组成化学物的关系，其中包括了46 914个药方、8 159种草药以及25 210个化合物(scientific reports)[6]。本研究利用BATMAN-TCM平台获取芎芍胶囊各组分对应的靶标基因，进行靶点预测、药靶功能分析及中药成分-靶点-通路-疾病网络的可视化呈现，以尝试揭示芎芍胶囊防治动脉粥样硬化的分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 预测靶标基因 将芎芍胶囊中川芎、赤芍分别导入BATMAN-TCM 平台进行靶标基因预测及分析；而后通过计算“芎芍胶囊化合物—靶标”与“已知药物—靶标”之间的相似性，并对潜在的药物靶标相互作用进行打分(score)[7]，并以score≥20分的靶标作为潜在的靶标基因。

1.2 靶标基因富集分析 靶标分析功能基于功能条目的富集分析，考察中药的潜在靶标可能具有的生物学功能及参与的生物学通路。靶标功能分析中涉及DrugBank (2015.7.26)、GO功能条目[8]，KEGG生物学通路[9](版本2014.7.31)以及OMIM/TTD[10](版本号4.3.02)疾病的富集分析是基于超几何分布设计的算法，而多重检验校正则使用的是Benjamini-Hochberg校正方法[11]。如果靶标在这些条目上的超几何分布检验校正后的P值小于设定卡值(本报告中设置P≤0.05)，可以认为靶标在这些条目上富集。同时给出这些靶蛋白显著富集的KEGG生物学通路、GO功能注释条目(包括生物学过程、分子功能和细胞定位三大类)、OMIOM/TTD疾病通路，以及统计检验的P值、条目相关的基因数量和基因列表等信息。这些显著富集的KEGG生物学通路和GO功能条目可能在中医药疗效的发挥中扮演了重要的角色，为中药分子作用机制的实验验证提供线索。

1.3 分析与动脉粥样硬化相关的靶标基因与通路 为了能够探索不同组分潜在的作用机制，本研究将化合物与他们的潜在靶标、相关疾病和通路关联，构建“组成化合物-靶标-生物学通路-疾病”的关联网络，使用cytoscape 3.2.0绘制关联网络图，将化合物、靶标、生物学通路及疾病以不同颜色和形状的节点来表示。

2 结 果

2.1 芎芍胶囊的潜在靶标基因 通过BATMAN-TCM 平台检索芎芍胶囊所含化合物有110种，如川芎中的川芎嗪、藁本内酯、阿魏酸等，赤芍中的芍药苷、没食子酸、儿茶素等。以化合物在BATMAN-TCM平台获取的靶标基因，score≥20 分的靶标基因共有965个，现列出预测的15个潜在的药物靶标基因。在 UniProt 数据库中检索这些基因对应的蛋白，包括与脂代谢相关的过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARD)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，与调节胆固醇摄取相关的核受体NR1H3、NR1H2，与脂质运输相关的微粒体甘油三酸酯转移蛋白(MTTP)等。详见表1。

2.2 靶标基因的富集分析

2.2.1 潜在的靶标分析之功能分布(GeneOntology) 利用2.3靶标分析方法，分析了其中965个潜在靶标分子(score≥20分)，发现在73个功能条目显著富集(P≤0.05)，如Signal Transducer Activity、Lipid Metabolic Process等这些与信号传导活性、脂质代谢功能条目，部分显著富集的功能条目详见表2。

2.2.2 潜在的靶标基因的分析之KEGG通路分布及可视化呈现 该部分生物学通路的分析方法同上，分析了965个潜在靶标分子(score≥20分)的KEGG生物学通路的分布，发现这些靶标分子倾向在53个通路显著富集(P≤0.05)，如脂肪酸代谢、讲解相关通路及脂代谢相关的PPARγ信号通路。部分显著富集的生物学通路详见表3。

表1 芎芍胶囊部分靶标基因(≥20分)

表2 芎芍胶囊部分靶标基因功能分布

表3 芎芍胶囊部分靶标基因KEGG通路分布

(续表3)

通路ID通路描述P基因数量 基因hsa00020Citrate cycle (TCA cy-cle)2.23E0412SUCLA2;SUCLG1;SDHC;OGDHL;OGDH;DLST;SDHA;SDHD;SDHB;ACO2;SUCLG2;DLDhsa00640Propanoate metabolism9.77E0513SUCLA2;ALDH2;SUCLG1;EHHADH;ABAT;ALDH1B1;ACSS2;SU-CLG2;ACAT1;ALDH7A1;ACADM;ACSS1;ALDH9A1hsa00071Fatty acid degradation2.23E0415ADH1A;ADH7;ADH4;ALDH2;EHHADH;ACSL3;ALDH1B1;ADH1B;ADH1C;ACADSB;ACAT1;ALDH7A1;ACADM;ACSL4;AL-DH9A1hsa00072Synthesis and degrada-tion of ketone bodies4.55E024OXCT1;OXCT2;BDH1;ACAT1hsa03320PPAR signaling path-way1.83E0522RXRA;APOA2;FABP6;FABP2;ACSL4;PPARG;CD36;FABP3;EH-HADH;SCD5;SCD;NR1H3;ADIPOQ;FADS2;RXRG;ACSL3;PPARA;RXRB;PPARD;ACADM;APOA1;CYP27A1

生物学通路的可视化：针对靶标分析得到富集的KEGG生物学通路，呈现靶标、靶标相互作用对象以及他们与上下游分子的调控关系。潜在靶标在PPAR signaling pathway通路上的覆盖情况详见图1。

注：红色标注为预测靶标
图1潜在靶标在PPARs信号通路的作用

2.2.3 潜在的靶标基因的分析之疾病分布(OMIM/TTD) 利用靶标分析方法，分别基于OMIM和TTD数据进行了965个潜在靶标分子(score ≥20分)的疾病富集分析，发现在5个OMIM以及25个TTD疾病条目显著富集(P≤0.05)，如动脉粥样硬化、冠心病、心律失常、心力衰竭等心脏相关疾病，糖尿病、代谢综合征等代谢相关疾病，哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸相关疾病。部分显著富集的疾病详见表4。

表4 芎芍胶囊部分靶标基因显著富集的疾病

2.2.4 与动脉粥样硬化相关的潜在靶标-生物学通路/疾病的网络可视化 将73个化合物与他们的679个潜在靶标、相关的疾病(79个OMIM和66个TTD)和167个通路关联。同时针对那些显著富集的通路、疾病条目构建了关联网络。根据部分的TTD疾病分析结果，选取了与动脉粥样硬化相关的13个靶标，构建了草药-化合物-潜在靶标-生物学通路/疾病的网络。详见表5、图2。

表5 芎芍胶囊与动脉粥样硬化相关靶标

图2与动脉粥样硬化相关的潜在靶标-生物学通路/疾病的网络

在该关联网络中，包含了5种类型的节点。不同类型的结果分别使用不同的颜色和形状来表示。其中绿色七边形表示草药墨，绿色菱形组成化合物，红色圆形表示药物的潜在靶标，紫色三角形表示KEGG生物学通路，浅棕色正方形表示OMIM收录的疾病，棕色正方形表示TTD收录的疾病。“组成化合物-靶标-生物学通路-疾病”的关联网络中还包含了3种联系(边)，分别是化合物与靶标的联系(如果这个靶标是TCM组成化合物的已知或潜在靶标)、靶标与通路的联系(如果这些靶标在某生物学通路上富集)、靶标与OMIM/TTD疾病的联系(如果这些靶标在该疾病条目富集)。靶标节点、生物学通路节点以及疾病节点的大小都会随着他们在网络中的连接度变化；连接度越大，节点越大。靶标节点的连接度由其相关的化合物数量决定。生物学通路节点的连接度由相关的靶标数量决定；同样的，疾病条目节点的连接度也由相关的靶标数量决定。

3 讨 论

本研究采用网络药理学方法预测到芎芍胶囊的潜在靶标基因965个，在53条通路显著富集，有13个靶标与动脉粥样硬化相关，涉及炎症反应、脂质运输与降解、糖脂代谢等过程，由图2可知，组方药物川芎、芍药中的多个化合物共同作用于PPARD、ESR1，直接参与脂肪酸降解、信号转导等脂质代谢过程，与冠状动脉粥样硬化、心肌梗死、肥胖、糖尿病等疾病相关，证实了芎芍胶囊中川芎、赤芍抗动脉粥样硬化的协同作用，其中川芎还参与了炎症反应、糖脂代谢等过程。预测结果与芎芍胶囊前期临床研究、实验研究中防治PCI术后冠状动脉再狭窄、促进胆固醇逆转运、抗炎相一致[2-4]，同时也为芎芍胶囊后续在抗动脉粥样硬化研究领域提供了新的思路。此外，芎芍胶囊还参与了心律失常、心力衰竭、糖尿病、代谢综合征、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等相关疾病。

本研究依据网络药理学原理，其实质是通过与已知的药物靶标的相互作用比较，进而计算相似性，并对潜在的药物靶标相互作用进行打分推算而来，存在一定的局限性，如无法预测不同药物组分的相互作用、无法量化药物的药理作用，而且不能预测尚未发现的抗动脉粥样硬化机制。课题组将在后续的研究中对预测的靶标基因和通路进行验证，深入探索芎芍胶囊抗动脉粥样硬化机制。综上可知，基于网络药理学分析后发现芎芍胶囊可能通过抑制炎症反应、调节糖脂代谢和信号转导等通路，发挥抗动脉粥样硬化作用。