高迁移率族蛋白1在蛛网膜下腔出血脑血管痉挛病人外周血中的表达及临床意义

，，，

脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)是自发性蛛网膜下腔出血(aneurysmalsubarachnoid hemorrhage，SAH)最常见、最严重的并发症之一，其最常见于动脉瘤破裂后3 d～10 d，可导致痉挛动脉供血区域脑血流(cerebral blood flow，CBF)减少，造成脑迟发缺血性神经功能恶化当其不能有效控制，或持续时间较长，最终会导致脑梗死的发生，所以CVS是蛛网膜下腔出血病人致残、致死的重要原因[1-2]。研究发现，SAH后的CVS发病机制与炎症反应密切相关[3]，而高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB-1)作为新发现的一种晚期炎症介质及致炎因子，广泛参与了关节炎、脓毒血症、失血性休克、缺血再灌注损伤等多种炎症病理过程[4]。本研究通过检测HMGB-1的表达情况，初步探讨HMGB-1在SAH后CVS中的临床意义，进而为其生理病理机制的研究提供新的思路及依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我科2014年1月—2017年6月收治的经诊断证实的自发性蛛网膜下腔出血，并且Hunt-Hess分级为Ⅰ～Ⅲ级的病人，SAH的诊断与治疗依据美国心脏学会/美国卒中学会诊疗指南进行。CVS的诊断标准[5]：①SAH发病后5～14 d内出现局灶性神经功能缺损或者意识能力下降；②CT平扫排除颅内再出血或者脑积水；③排除导致神经功能下降的其他因素；④经颅多普勒超声(TCD)检测血流速度：大脑中动脉(MCA)>200 cm/s，大脑前动脉(ACA)≥120 cm/s，大脑后动脉(PCA)>90 cm/s。此外，排除免疫系统疾病，严重感染，血液疾病，恶性肿瘤及严重肝、肾功能不全病人。本研究经山西医科大学第一医院伦理委员会批准，所有纳入病人均签署知情同意书。

1.2 HMGB-1的检测

1.2.1 主要仪器与试剂 超净台购自苏洁净化设备公司；酶标仪购自美国Bio-Rad 公司；离心机(Eppendorf Centrifuge 5417 R)购自德国Eppendorf公司；HMGB-1 ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.2 ELISA法检测血清HMGB-1水平 蛛网膜下腔出血病人均于入院12 h之内留取外周血3 mL，同时收集病人1 d～10 d的新鲜外周血，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，于-80 ℃冰箱保存备用。按照ELISA检测试剂盒说明书检测病人血清HMGB-1的水平。操作完成后用酶标仪在450 nm波长处检测待测样品的吸光度值(OD值)，绘制标准曲线，依照标准曲线测量样品数值从而得出样品含量。

2 结 果

2.1 一般资料比较 按照纳入排除标准，共纳入病人65例。根据其随后是否发生脑血管痉挛分为CVS组(20例)及Non-CVS组(45例)，两组病人年龄、性别、吸烟史、高血压病史、发病至治疗时间等差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.2 不同蛛网膜下腔出血病人血清HMGB-1表达的动态变化情况 分别隔天监测了Non-CVS及CVS组病人入院后第1天～第11天外周血HMGB-1的表达水平，结果显示不同组病人HMGB-1水平均在第5天～第7天达到高峰，随后开始下降，且CVS组病人外周血HMGB-1表达高峰时间长于Non-CVS组。详见图1。

表1 自发性蛛网膜下腔出血病人

图1不同组别蛛网膜下腔出血病人外周血HMGB-1表达的动态变化情况

2.3 蛛网膜下腔出血病人血清HMGB-1表达与Hunt-Hess分级的关系 蛛网膜下腔出血病人血清中HMGB-1表达水平与Hunt-Hess分级呈明显正相关(r=0.670 7，P<0.00 01)。

2.4 蛛网膜下腔出血病人血清HMGB-1表达与Fisher分级的关系 蛛网膜下腔出血病人血清中HMGB-1表达水平与Fisher分级呈显著正相关(r=0.740 7，P<0.00 01)。

3 讨 论

近年来，大量的研究发现SAH以及CVS很大程度上是由于炎症因子的致炎作用。SAH后蛛网膜下腔产生多种炎性介质，如细胞因子、黏附分子、补体等。此外，在对CVS血管壁的研究中发现，在管壁中层有大量免疫球蛋白IgG和补体C3沉积，且沉积量与CVS的严重程度呈显著正相关[6]。随后的临床及动物实验中均发现相比正常脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)，SAH后CSF中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等多种重要的炎症因子均有所升高，且水平越高预后越差[7]。

HMGB是一类存在于哺乳动物的核蛋白家族，包括HMGB-1、HMGB-2及HMGB-3 ，其中HMGB-1广泛分布于真核细胞内。通常当机体内环境处于稳态时，HMGB-1存在于细胞核中，当受到外界刺激打破平衡时，HMGB-1 的赖氨酸残基乙酰化后释放到胞外，再通过一系列下游的作用开始发挥致炎作用[8]，是参与整个炎症过程的关键介质。研究发现，HMGB-1能够促进内皮细胞释放细胞间黏附分子及TNF-α、白细胞介素-8(IL-8)等多种细胞因子表达[9]。在炎症过程中，HMGB-1与RAGE、TLR2或TLR4结合，再通过MAPK及Erk1/2等信号通路激活核转录因子(NF-κB)，从而能够调控下游基因的转录过程，释放大量趋化因子和细胞因子，诱导炎症反应，同时释放的细胞因子又可导致HMGB-1的进一步释放，形成正反馈通路，最终产生炎症的“级联瀑布”效应[10]。

本研究发现，相比没有发生CVS的SAH病人，CVS病人血清HMGB-1表达明显升高，而通过对HMGB-1的动态监测发现，CVS组病人外周血HMGB-1表达高峰时间长于Non-CVS组，进一步研究发现，SAH病人HMGB1的表达与Hunt-Hess分级及Fisher分级均呈显著正相关关系。以上研究结果表明，HMGB-1的过表达不仅可能导致SAH病人出现CVS，且HMGB-1的表达过高与SAH病人的严重程度密切相关。与本研究结果相似，Murakami等[11]通过兔SAH实验模型发现，与假手术组比较，SAH组脑干组织在造模第5天 HMGB-1的基因水平增加5倍以上，表明SAH可以明显上调促炎因子HMGB-1的表达，从而造成脑损伤。Nakahara等[12]研究发现，发病3 d、7 d、14 d SAH病人CSF中HMGB-1水平是影响SAH病人发生脑血管痉挛及预后的一个重要的独立危险因素。

综上所述，SAH后发生CVS的病人HMGB-1表达升高，且与病情的严重程度相关，提示HMGB-1可作为判断SAH预后及CVS发生率的特异性生物学标志物。此外，HMGB-1作为一种重要的炎症介质，参与脑损伤及脑血管痉挛的病理生理过程。因此，可以通过抗体或药物抑制HMGB-1，减轻炎症反应，降低脑血管痉挛的发生率，从而改善SAH病人的预后，为SAH的治疗提供了新的思路。