miR-202通过降低肝癌细胞ROCK1表达抑制其迁移和侵袭

袁琳琳，喻晓芬

（浙江省人民医院 手术室，浙江 杭州 310014）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，其症状隐匿，在初次被发现时多处于中晚期，严重威胁患者健康[1]。对于中晚期HCC患者，目前能够显著延长患者总体生存期的靶向治疗药物依然有限，因此这类患者的总体预后依然较差[2]。近年来，微小RNA（microRNA，miRNA）在恶性肿瘤发生发展中的作用逐渐引起重视[3]。miRNA能够结合在下游靶基因的3’端非编码区，导致靶基因mRNA的降解或翻译受阻，从而抑制靶基因的表达，发挥调控肿瘤细胞增殖、运动、耐药性等生物学功能[4]。大量研究表明，多种miRNA在HCC中存在异常表达，并且与HCC患者的临床病理特征及预后具有显著相关性[5]。miR-202近来被发现在多种恶性肿瘤组织中存在异常表达，其在胃癌[6]、骨肉瘤[7]及胰腺癌[8]中存在低表达，能够抑制肿瘤细胞的增殖，从而发挥抑癌作用。有研究表明miR-202在HCC组织中低表达，且能抑制HCC细胞的增殖[9]。然而，miR-202对HCC细胞侵袭转移能力的调控作用目前仍不明确。本研究拟通过Transwell实验和Western blot实验探明miR-202对HCC细胞迁移侵袭能力以及上皮间质转化的影响，并进一步检索生物信息学数据库发现miR-202在HCC细胞中的作用靶点，利用Western blot及荧光素酶实验证实miR-202对下游靶点的调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌细胞系（Hep3B、Huh7、HCCLM3细胞）及永生化的正常肝细胞LO2购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），并在液氮中长期冻存。本实验所用细胞均利用DMEM培养基进行培养。DMEM培养基、胎牛血清、抗生素购自美国Gibico公司；转染试剂Lipofectamine 2000、荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；miR-202模拟物（miR-202 mimic）和miRNA空白对照（miRNA control，miR-control）、miR-202抑制物（miR-202 inhibitor）和miRNA阴性对照（miRNA negative control，miR-NC）、野生型Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1，ROCK1）3’-UTR质粒和突变型ROCK13’-UTR质粒购自广州市锐博生物科技有限公司；Transwell孔板购自美国Corning公司；兔抗GAPDH抗体、兔抗E-cadherin抗体、鼠抗N-cadherin抗体、鼠抗ROCK1抗体购自美国Cell Signaling公司；HRP标记的山羊抗鼠/兔二抗购自北京兰博利德公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏、培养及转染：提取冻存于液氮的HCC细胞系及LO2细胞，置于37 ℃水浴箱快速解冻后，加入5 mL无血清DMEM培养基，1000 r/min离心5 min后，弃去上清，利用10 mL含有10% FBS的DMEM培养基重悬后，接种于细胞培养皿，置于37 ℃恒温细胞培养箱中培养，隔日更换细胞培养基，每日观察细胞生长状况。当细胞融合度达50%～70%时，根据Lippofectamine2000试剂盒说明书将miR-202 mimic、miR-control、miR-202 inhibitor及miR-NC终浓度调整为5 mmol/L后，加入6孔板细胞中，培养24 h后，更换为含10% FBS的DMEM培养基，48 h后，qRT-PCR检测转染效果，并将细胞用于后续实验。

1.2.2 Transwell实验：将HCCLM3细胞分为HCCLM3空白对照组和miR-202过表达组，将Hep3B细胞分为Hep3B阴性对照组和miR-202敲低组。胰酶消化上述细胞后，利用无血清DMEM培养基重悬细胞，并将细胞密度调整至1×106/mL备用。向Transwell孔板（24孔）的实验孔中加入700 μL含有10% FBS的DMEM培养基；向Transwell小室中加入200 μL上述备用细胞悬液，并将盛有细胞悬液的Transwell小室置于含有培养基的实验孔中；将上述Transwell孔板置于细胞培养箱中培养24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉签擦去小室薄膜上层细胞后，结晶紫染色薄膜下层细胞后，置于显微镜下计数拍照。对于侵袭能力检测，在向Transwell小室接种细胞悬液前，在每个小室膜上滴加70 μL利用DMEM稀释的基质胶，待基质胶固化后再接种细胞，其余步骤同上。

1.2.3 实时定量PCR：使用Trizol提取细胞内RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。利用荧光定量PCR试剂盒检测细胞内miR-202及ROCK1 mNRA的表达；分别用U6和GAPDH作为miR-202及ROCK1的内参，引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

1.2.4 Western blot检测细胞内ROCK1及GAPDH蛋白的表达：使用RIPA裂解液提取细胞内的蛋白，细胞充分裂解后，14000 r/min离心15 min后，去蛋白上清，利用BCA试剂盒测定蛋白浓度；SDS-PAGE胶的上样孔中每孔加入50 μg蛋白样品，电泳分离蛋白后，采用半干转膜系统，20 V转膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别加入ROCK1抗体（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶1000），4 ℃冰箱孵育过夜后，TBST缓冲液漂洗3次，每次5 min，分别加入山羊抗兔或鼠IgG二抗（1∶5000），室温孵育1 h TBST缓冲液漂洗3次，每次5 min。暗室中，在膜上滴加ECL发光液显影。

1.2.5 荧光素酶报告基因实验：将Hep3B细胞分为如下8组：miR-control与野生型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-202 mimic与野生型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-NC与野生型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-202 inhibitor与野生型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-control与突变型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-202 mimic与突变型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-NC与突变型ROCK13’-UTR质粒共转染组，miR-202 inhibitor与突变型ROCK13’-UTR质粒共转染组。共转染完成后48 h收集细胞。按双荧光素酶活性检测试剂盒说明书操作，用荧光检测仪检测荧光素酶活性。

1.3 统计学处理方法 利用GraphPad Prism软件进行数据分析。计量资料以±s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-202在肝癌细胞系中低表达 与永生化的正常肝细胞LO2相比，3种肝癌细胞Hep3B、Huh7、HCCLM3细胞中miR-202的表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。在3种HCC细胞中，miR-202在Hep3B中的表达水平最高，而在HCCLM3细胞中的表达水平最低。因此，本研究选择Hep3B细胞进行miR-202的敲低实验，选择HCCLM3细胞进行miR-202的过表达实验。

图1 miR-202在3种肝癌细胞及正常肝细胞LO2中的表达

2.2 HCCLM3细胞中过表达miR-202 与miR-control组比，转染miR-202 mimic可显著增加HCCLM3细胞中的miR-202表达水平，差异有统计学意义（1.00±0.05 vs. 8.99±1.25，P＜0.01）。

2.3 过表达miR-202降低HCCLM3细胞的迁移和侵袭能力 Transwell迁移实验结果显示：过表达miR-202后，HCCLM3的迁移能力显著降低（P＜0.05）；侵袭实验结果显示：过表达miR-202后，HCCLM3的侵袭能力显著降低（P＜0.05）。见图2。

2.4 Hep3B细胞中敲低miR-202 与miR-NC组相比，转染miR-202 inhibitor可显著降低Hep3B细胞中的miR-202表达水平，差异有统计学意义（1.00±0.06 vs.0.12±0.02，P＜0.01）。

2.5 敲低miR-202增强Hep3B细胞的迁移和侵袭能力 Transwell迁移实验结果显示：敲低miR-202后，Hep3B细胞的迁移能力显著降低（P＜0.05）；侵袭实验结果显示：敲低miR-202后，Hep3B细胞的侵袭能力显著降低（P＜0.05）。见图3。

2.6 生物信息学网站预测和荧光素酶报告基因实验验证miR-202靶基因为ROCK1 通过miRNA靶基因预测网站TargetScan，miR-202可能的靶基因为ROCK1。miR-202与ROCK1的3’-UTR间存在互补配对序列（见图4A）。进一步的荧光素酶报告基因实验结果显示，过表达miR-202后，野生型ROCK13’-UTR组细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；敲低miR-202后，野生型ROCK13’-UTR组细胞荧光素酶活性显著增加（P＜0.05）；过表达或敲低miR-202对突变型ROCK13’-UTR组细胞荧光素酶活性没有显著影响。见图4B。

图3 敲低miR-202增强Hep3B细胞的迁移（A）及侵袭（B）能力

图4 生物信息学网站预测及miR-202调控ROCK13’-UTR的荧光素酶活性

2.7 过表达miR-202后HCCLM3细胞ROCK1表达降低 实时定量PCR检测结果显示，miR-202 mimic组HCCLM3细胞中ROCK1 mRNA水平较miR-control组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5A；Western blot结果表明，过表达miR-202后HCCLM3细胞中ROCK1蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5B。

2.8 敲低miR-202后HCCLM3细胞ROCK1表达增加实时定量PCR检测结果显示，miR-202 inhibitor组Hep3B细胞中ROCK1 mRNA水平较miR-NC组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6A；Western blot结果表明，过表达miR-202后HCCLM3细胞中ROCK1蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6B。

3 讨论

miRNA在肝癌发生发展中的作用近年来逐渐引起关注[10]。多种miRNA，如miR-7[11]、miR-92a[12]及miR-122[13]等被发现在肝癌组织中存在异常表达，且与肝癌患者的临床病理特征及预后具有显著相关性。因此，miRNA已被作为肝癌患者诊断及预后评估的潜在生物学标志物，并有望成为肝癌治疗的新靶点。miR-202是近来被发现的在多种肿瘤中存在异常表达的miRNA。研究数据显示：miR-202在胃癌[6]、骨肉瘤[7]及胰腺癌[8]中存在低表达，能够抑制肿瘤细胞的生长及转移，发挥抑癌作用。然而，miR-202对肝癌细胞的影响，尤其是迁移和侵袭能力的影响，目前仍不明确。

图5 实时定量PCR（A）和Western blot（B）检测过表达miR-202对ROCK1表达的影响

图6 实时定量PCR（A）和Western blot（B）检测敲低miR-202对ROCK1表达的影响

基于上述研究背景，本研究利用qRT-PCR、Western blot、Transwell实验以及荧光素酶报告基因等分子生物学技术手段探明miR-202对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响及可能分子机制。本研究结果表明：miR-202通过抑制肝癌细胞的侵袭能力，在肝癌病情进展中发挥抑癌作用。本研究进一步通过对生物信息学网站TargetScan检索发现，ROCK1基因的3’-UTR含有与miR-202的互补配对序列，可能是miR-202的靶基因。进一步利用荧光素酶实验证实miR-202能够与ROCK13’-UTR结合，表明ROCK1是miR-202的靶基因。qRT-PCR及Western blot实验表明：miR-202能够抑制细胞ROCK1的表达。值得关注的是：骨肉瘤中的研究显示Gli2蛋白是miR-202的靶基因[7]；而在胰腺癌中的研究发现，miR-202可调控细胞内Mxd1和Sin3A的表达[8]。这些研究结果表明：miR-202在不同的肿瘤中具有不同的下游靶点。miR-202在肝癌中是否具有其他的下游作用靶点仍需进一步研究。

本研究所发现的miR-202的下游靶基因即ROCK1基因，是ROCK家族的一员，在多种肿瘤中高表达，并对肿瘤细胞的运动能力具有直接调控作用[14]。乳腺癌中的研究表明：miR-340通过抑制ROCK1的表达，发挥对乳腺癌细胞转移能力的抑制作用[15]。膀胱癌中的研究表明：miR-1280通过抑制ROCK1的表达，发挥对膀胱癌细胞转移能力的抑制作用[16]。上述既往研究结果表明：ROCK1是多种miRNA的下游靶点。

综上所述，miR-202在肝癌细胞中呈显著低表达，能够抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力；miR-202能够与ROCK13’-UTR结合，抑制肝癌细胞内ROCK1的表达。因此，miR-202可能通过抑制ROCK1的表达发挥对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。miR-202有望成为肝癌诊断及预后评估的新生物学标志物，可能成为肝癌治疗的新靶点。