IIFT法检测血清抗-PLA2R抗体诊断特发性膜性肾病的效应

姚丽莉，陈孝倩，黄朝兴

（1.温州医科大学附属第一医院 肾内科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第五医院 肾内科，浙江 丽水 323000）

M型磷脂酶A2受体（M-type phospholipase A2receptor，PLA2R）是成人特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）的主要靶抗原。BECK等[1]发现IMN患者血清抗-PLA2R抗体70%阳性，且从肾活检组织洗脱出的IgG可与PLA2R抗原起反应。检测血清抗-PLA2R抗体现已成为诊断IMN的一个很有价值的非创伤性检查手段。

目前检测血清抗-PLA2R抗体的方法最常用是ELISA法，其次是间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence testing，IIFT）法。有研究[2-3]提示IIFT法的敏感度略优于ELISA法。本研究以104例经肾活检诊断肾小球疾病患者为对象，分别采用IIFT法和ELISA法检查血抗-PLA2R抗体，研究IIFT法对IMN诊断的灵敏度和特异度。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2016年1月至2017年7月间选择温州医科大学附属第一医院肾内科经肾活检诊断肾小球疾病患者共104例，其中IMN 80例，继发性膜性肾病（secondary membranous nephropathy，SMN）7例，非膜性肾病（membranous nephropathy，MN）17例。MN所有患者均为初次发病的病例。104例被随机分为IIFT组40例和ELISA组64例，分别采取IIFT法和ELISA法检测抗-PLA2R抗体，抽取清晨空腹血样。本研究经过温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 诊断标准 成人IMN的判断标准：①年龄＞16岁；②病理符合膜性肾病；③排除系统性红斑狼疮等继发性自身免疫病、乙型病毒性肝炎、肿瘤和药物等继发性因素。狼疮性肾炎病理分型参照2003年由国际肾脏病学会和肾脏病理学会修订的分类标准（ISN/RPS）[4]。乙型肝炎病毒相关肾炎（nepatitis B-associated nephritis，HBV-GN）的诊断参照国内肾活检病理诊断标准指导意见[5]。

1.3 检验方法

1.3.1 IIFT法测定血清抗-PLA2R抗体：试剂盒购自德国欧蒙公司，按照试剂盒的操作步骤严格执行。由温州医科大学附属第一医院肾脏检验室1位专职技师于显微镜下观察荧光模型判读结果。显微镜下产生明显高于阴性对照的特异荧光，且有鲜明可以辨认的荧光模式，判定为阳性。

1.3.2 ELISA法测定血清抗-PLA2R抗体：送检样本由杭州金域检测公司检测完成。试剂盒购自德国欧蒙公司，酶标仪测量光密度（OD值）及浓度。阳性结果判定标准：抗-PLA2R抗体浓度＞14 RU/mL记录结果为阳性。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用±s表示，计数资料用频数或百分比表示。正态计量资料组间比较用t检验或方差分析；计数资料组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.12组IMN患者一般情况比较 IIFT组和ELISA组IMN患者的年龄、性别、血浆白蛋白、尿蛋白定量、血脂差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 2组IMN患者一般情况比较

2.2 IIFT法检测血清抗-PLA2R抗体 IIFT组采用IIF法检测血清抗-PLA2R抗体40例，其中33例IMN，阳性26例，敏感度为78.8%；2例SMN（肿瘤合并MN）均阴性。设为组内对照的非MN 5例（微小病变肾病2例，狼疮性肾炎IV型、乙型肝炎病毒相关性系膜毛细血管性肾小球肾炎、IgA肾病各1例），其中1例狼疮性肾炎IV型可疑阳性，其余患者均阴性。IIFT法检测血抗-PLA2R抗体阳性的信号见图1。

图1 IIFT法血清抗-PLA2R抗体阳性（免疫荧光染色，×400）

2.3 ELISA法检测血清抗-PLA2R抗体 ELISA组采用ELISA法检测血清抗-PLA2R抗体64例，其中IMN 47例，阳性37例，敏感度为78.7%；SMN 5例（狼疮性肾炎V型2例，慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN 1例、干燥综合征合并MN 1例和结肠癌合并MN 1例），其中1例慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN和1例结肠癌合并MN患者血抗-PLA2R抗体阳性，其余均为阴性。设为组内对照的非MN 12例（局灶节段性肾小球硬化4例，微小病变2例，淀粉样病变2例，IgA肾病、系膜毛细血管性肾小球肾炎、糖尿病肾病、高血压肾病各1例）均为阴性。

3 讨论

BECK等[1]采用Western blot法检测血清抗-PLA2R抗体对IMN诊断的灵敏度为70%，特异度为100%。目前，检测血清抗-PLA2R抗体的方法有4种：ELISA、IIFT、Western blot和时间分辨荧光分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，FIA），国内可用于临床的有证产品目前仅2种：ELISA法和IIFT法。Meta分析[6]显示，采用不同检测方法对IMN诊断总的灵敏度为65%（63%～67%），特异度为97%（97～98%）；其中ELISA法集成的诊断OR（95%CI）为45.53（26.78～77.38），无异质性，曲线下面积（AUC）为0.9348；IIFT法集成的诊断OR（95%CI）为40.77（19.00～87.50），异质性为61.7%，AUC为0.9296。

研究[7]显示，采用Western blot、IIFT以及ELISA法这3种方法对血清抗-PLA2R抗体的检出率是存在一些差别的。HOFSTRA等[2]研究了117例IMN，血清中抗-PLA2R抗体的检测阳性率在IIFT法和ELISA法分别为74%和72%，2种方法的一致性较好（94%一致，κ=0.85）。DAHNRICH等[3]对200例采用IIFT法证实的PLA2R相关性膜性肾病（PLA2R-MN）患者同时用ELASA法检测，结果有7例阴性。在HOFS-TRA等[2]研究的117例PLA2R-MN中，5例IIFT阳性但ELISA阴性，2例IIFT阴性而ELISA阳性。管音等[8]对59例IMN采用IIFT法检测血清抗-PLA2R抗体的灵敏度为69.5%，特异度为95.2%。本研究结果显示，IIFT法检测IMN血清抗-PLA2R抗体的灵敏度为78.8%，ELISA法检测IMN血清抗-PLA2R抗体的灵敏度为78.7%。

在本研究结合临床和病理确诊的IMN患者中，分别有21.2%（7/33）经IIFT法检测和21.3%（10/47例）经ELISA法检测结果为阴性，可能的解释为：①采集患者血样时，部分患者可能正处在疾病缓解过程中，即患者可能正处于一种低水平的免疫活动状态，使体内的抗体水平处于一种低滴度状态，使用的试剂未能检测出其结果。HOFSTRA等[7]检测18例IMN患者体内的血清抗-PLA2R抗体，其中14例阳性，1例阴性，4个月后再次对阴性患者检测，结果发现其血清中抗-PLA2R抗体呈阳性反应。②IMN患者除了PLA2R以外，可能还存在其他自身靶抗原，已发现部分抗-PLA2R抗体阴性的IMN患者体内可以检测到血小板反应蛋白7A域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A）的自身抗体。但HOXHA等[9]的研究显示，THSD7A也可能是肿瘤组织释放的抗原，由机体免疫识别后产生循环中相应抗体，这些抗体可特异性结合肾小球足细胞上的THSD7A抗原形成免疫复合物导致MN。③抗-PLA2R抗体的检测结果受转染细胞内靶抗原的构象和表达水平的影响，造成抗体检测结果的误差。

HOFSTRA等[2]研究了82例PLA2R-MN，血清抗-PLA2R抗体滴度与基线尿蛋白水平显著相关（P=0.02），高抗体滴度患者的自然缓解率明显较低（最低滴度为38%，最高滴度为4%；P＜0.01）。本研究2组IMN的尿蛋白定量和血浆白蛋白水平均无明显差别，可基本排除疾病严重程度对不同方法检测抗-PLA2R抗体敏感度的影响。

鉴于检测血清抗-PLA2R抗体对IMN诊断具有高度特异性，一般认为血清抗-PLA2R抗体阳性诊断IMN几乎是不用怀疑的。在本研究中，1例直肠癌合并膜性肾病患者抗-PLA2R抗体阳性，该例肾活检组织免疫荧光以IgG4为主，在直肠癌切除术后5月肾病仍未缓解，提示该例可能为肿瘤合并IMN。

另1例ELISA法检测血清抗-PLA2R抗体阳性为慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN，该患者乙肝大三阳，HBV-DNA阳性，肾活检免疫荧光IgG4为主，肾组织HBsAg和HBcAg阴性；电镜下伴副系膜区电子致密物。该例虽然尚不能确诊为乙肝病毒相关性MN，也不能完全排除之。此外，ELISA组12例非MN均阴性，本研究ELISA法的特异度为94.1%（16/17例）。

IIFT组的2例SMN检测血清抗-PLA2R抗体均为阴性，但组内对照5例中有1例狼疮性肾炎IV型（病理结果为弥漫增生型肾小球肾炎，结合电镜已排除合并狼疮性肾炎V型）为可疑阳性，推测这可能是由抗核抗体引起的。一项涉及SMN患者抗-PLA2R抗体的研究[10]显示，5%的V型狼疮性肾炎可检测到该抗体。本研究IIFT法的特异度为85.7%（6/7），特异度偏低可能与组内SMN及对照的例数较少有关。

在成人IMN的诊断上，IIFT法检测血清抗-PLA2R抗体的灵敏性和特异度与ELISA法大致相当，这2种方法对诊断IMN均具有很好的实用价值。本研究尚存在一些局限性，如未在同一例患者同时进行2种方法检测、未检查肾组织内PLA2R及入组的SMN患者例数不够多等，今后有待扩大样本量、结合2种方法及肾组织内PLA2R检查进一步研究。