miRNA调控EMT机制对鼻咽癌细胞侵袭及迁移的影响

孙瑜宁 张美丽 张恩东

鼻咽癌是1种在我国较常见的发生于鼻咽上皮的严重影响人身体健康的恶性肿瘤，发病率居各种常发恶性肿瘤第10位，死亡率居常发各种恶性肿瘤第9位[1]。鼻咽癌的发病原因多样，目前国内外的医学工作者尚未给出明确的发病机制，肿瘤细胞的增值、侵袭和转移是1个多步骤、多因素的过程，可能与人们的生活环境、生活习惯等有着密切的关系[2-3]。miRNA是1种长约18～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其作用机制是通过与多个靶基因的不完全互补配对，通过转录作用抑制基因的表达[4-5]。在鼻咽癌的发展过程中，多个miRNA参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭、分化、转移等，严重影响患者的预后。EMT是上皮-间充质转化，是肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的1种生物学过程。为更深入分析了解miRNA调控EMT机制对鼻咽癌细胞侵袭及迁移的影响，本次采取控制单一变量方法进行研究分析，为诊断治疗鼻咽癌提供新的依据，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取自2013年5月至2017年5月本科室接诊的226例患者为研究对象，确诊为鼻咽癌并在本科室实施治疗的患者158例，非鼻咽癌患者68例。患者年龄为35～75岁，平均年龄(57.7±8.6)岁。各组患者的年龄、身高、体重和病程等临床资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 各组一般临床资料比较

1.2 样本纳入排除标准

纳入标准：确诊患者为鼻咽癌患者[6]；患者未患有影响本次研究的其他疾病；入本院之前未进行放疗、化疗、激素等治疗；同意参加本次研究。

排除标准：患者诊断、治疗等病历资料不全者；手术之前经评估肿瘤无法完整切除的患者；无法参与研究的；中途退出研究的。

1.3 研究方法

应用细胞划痕实验检测鼻咽癌患者和非鼻咽癌患者鼻咽癌细胞的迁移能力，使用上海蒲拓光电仪器有限公司生产的XS-10B型号倒置光学显微镜观察肿瘤细胞形态，应用MTT法检测鼻咽癌和非鼻咽癌患者鼻咽癌细胞HNE1/DDP、HNE1针对不同浓度的顺铂(简称DDP，德州德药制药有限公司生产)浓度表达水平。使用miRNA芯片技术检测鼻咽癌细胞HNE1中miRNA的表达水平，采用荧光定量RT-PCR法检测mRNA的水平，所有操作均由具有10年以上经验的医师进行。

1.4 观察指标

观察记录患者的姓名、年龄、身高、体重、病程、肿瘤大小等基本信息，密切观察患者病情变化，记录患者手术过程中出现的不良反应、手术时间等情况，及时监测患者生化指标，记录患者治疗效果和患者满意度等指标。

1.5 统计方法

应用SPSS 18.0(Statistical Product and Service Solutions 18.0，统计产品与服务解决方案)软件对采集到的数据资料作统计学分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂对患者鼻咽癌细胞增殖能力的影响

两组患者HNE1/DDP浓度分别为(28.59±0.92)μmol/l、(15.23±0.83)μmol/l，HNE1浓度分别为(5.36±0.35)μmol/l、(4.02±0.23)μmol/l，鼻咽癌患者明显高于非鼻咽癌患者，鼻咽癌患者耐药指数4.37，低于非鼻咽癌患者的5.68，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 鼻咽癌细胞的侵袭和迁徙情况

使用细胞划痕实验观察患者的肿瘤细胞的侵袭和迁移情况，鼻咽癌患者的肿瘤细胞HNE1/DDP的迁移距离为1.1 mm，HNE1为0.4 mm，HNE1/DDP的侵袭距离为2.1 mm，HNE1为1.2 mm，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 患者发生EMT情况

使用显微镜观察肿瘤细胞的形态，采用RT-PCR法检测细胞标记物情况，检测结果显示：HNE1细胞中间质标志分子的表达水平1.1，明显低于HNE1/DDP水平12.3，中上皮标志分子表达水平0.86，明显高于HNE1/DD水平0.23。HNE1细胞转录因子snail等水平明显低于HNE1/DDP水平，这即说明HNE1/DDP细胞相对于HNE1细胞发生了上皮-间充质转化，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 鼻咽癌细胞中miRNA的表达水平

HNE1/DDP细胞相比于HNE1细胞有8个miRNA表达下调和17个miRNA表达上调(|LogFC|>2，FC为fold chagne的简称)，其中mir-10b-5p最具差异表达miRNA，其表达上调达到15倍，见表2。

表2 鼻咽癌细胞中miRNA表达情况

3 讨论

近年来，我国癌症发病人数及发病速度均在不断增多和加快[7-9]。癌症已经成为严重影响和制约我国人民身体素质发展的重要因素。影响癌症发展的主要有肿瘤细胞分化程度、肿瘤细胞浸润深度、淋巴结转移程度等[10-11]。及早发现，及早治疗，是能有效治疗和控制癌症的最为有效的方法[12]。但是，一般情况下，癌症病人发现患病即为癌症中晚期，给治疗带来极大困难。尤其是鼻咽癌，前期发现较难，患者一般在偶然检查中发现，给患者及家属带来巨大的精神压力和经济负担[13]。能尽快而且很方便的诊断癌症已是广大医护人员和患者的最大呼声。近几年，大量的医护人员通过检测miRNA在鼻咽癌组织中表达水平来诊断分析鼻咽癌及研究癌细胞的迁移变化[14]。顺铂是1种治疗鼻咽癌较为有效的非特异性抗肿瘤药物，在肿瘤细胞转移中发挥着重要的作用。肿瘤细胞耐药与肿瘤细胞发生EMT密切相关，会导致肿瘤细胞的侵袭和迁移。随着科学技术和医学水平的发展和提高，人们对癌症的认识正在逐步加深。

本次研究表明，患者的身高、体重、年龄、病程等分布差异无统计学意义，对鼻咽癌细胞的分化、迁移等影响不明显。两组患者HNE1/DDP浓度分别为28.59±0.92、15.23±0.83，HNE1浓度分别为5.36±0.35、4.02±0.23，鼻咽癌患者明显高于非鼻咽癌患者，鼻咽癌患者耐药指数4.37，低于非鼻咽癌患者的5.68。使用细胞划痕实验观察患者的肿瘤细胞的侵袭和迁移情况，鼻咽癌患者的肿瘤细胞HNE1/DDP的迁移距离为1.1 mm，HNE1为0.4 mm，HNE1/DDP的侵袭距离为2.1 mm，HNE1为1.2 mm。使用显微镜观察肿瘤细胞的形态，使用RT-PCR法检测细胞标记物情况，检测结果显示：HNE1细胞中间质标志分子的表达水平1.1，明显低于HNE1/DDP水平12.3，中上皮标志分子表达水平0.86，明显高于HNE1/DD水平0.23。HNE1细胞转录因子snail等水平明显低于HNE1/DDP水平，这即说明HNE1/DDP细胞相对于HNE1细胞发生了上皮-间充质转化。miRNA通过调控靶基因的表达，来影响肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、迁移和死亡，而且与肿瘤细胞的耐药性密切相关，HNE1/DDP细胞相比于HNE1细胞有8个miRNA表达下调和17个miRNA表达上调，其中mir-10b-5p最具差异表达miRNA，其表达上调达到15倍。这和国内部分专家的研究结果基本一致[15-16]。

综上所述，miRNA在鼻咽癌肿瘤细胞中差异化表达，在EMT和顺铂耐药性中起重要作用，mir-10b-5p促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，引发EMT的发生，为研究和治疗鼻咽癌提供科学依据，为鼻咽癌患者提供准确的治疗时机，给患者及家属减轻精神和经济负担，同时，为广大医护人员积累了经验，可广泛推广应用。