N-乙酰氨基葡萄糖转移酶对卵巢癌细胞增殖与侵袭的作用分析

杜文渊 宁 苗

现代研究表明卵巢癌的发生与发展是1个由多基因参与的，多环节、多阶段、多步骤的复杂过程，其具体机制至今尚未明确[1]。从分子生物学水平研究与探讨卵巢癌的增殖、侵袭等病理过程的关键节点，可为其早期治疗提供新的靶点[2]。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(n-acetylglucosamine transferase，GnT)的编码基因是Mgat5，可催化结构型N-糖链的产生，可通过和半乳糖凝集素的相互作用来影响细胞表面的生长因子受体等糖蛋白，从而对细胞的生长与增殖进行调控[3-4]。当前部分研究表明N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关[5-6]，但与卵巢癌恶性生物学行为的相关研究较少。本文具体探讨了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶对卵巢癌细胞增殖与侵袭的作用，旨在探索N-乙酰氨基葡萄糖转移酶与卵巢癌的相关性，希望为卵巢癌的诊断和治疗提供理论依据。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵巢癌A2780细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，采用RPMI1640+10%血清加以培养；si-GnT及其无关序列的阴性腺病毒对照siNC前期已构建；免疫印迹化学发光系统购自Syngene公司提供；Transwell小室购自Corning公司(8 μm)；Martrigel胶购自BD公司；流式细胞仪为Beckman公司产品；脂质体Lipo-fectamine2000购自Invitrogen公司；MTT检测试剂盒购自Sigma公司。MMP-9单克隆抗体、兔抗人β-actin、Bcl-2从Abcam公司购买。

1.2 细胞培养与病毒转染

卵巢癌A2780细胞进行常规培养，选择0.25%胰蛋白酶进行消化传代。在病毒转染中，取对数生长期细胞，分别使用腺病毒包装质粒si-GnT、siNC转染细胞(si-GnT组、siNC组)，感染复数(MOI)为50，空白组加入等量的磷酸盐缓冲液(PBS)，12 h换液1次，转染后48 h采用qRT-PCR检测N-乙酰氨基葡萄糖转移酶表达情况。

1.3 MTT法检测细胞增殖

转染后将细胞接种于密度5000个/孔的96培养板，培养48 h后吸液器吸去上层培养基后，每孔加入20 μl MTT和80 μl新鲜培养基，继续于培养箱内培养4 h。小心吸去孔内废液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，酶标仪被用来检测吸光值，计算细胞活力。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期

转染48 h后，取冷乙醇固定细胞样品，用PBS洗涤3次，每次5 min，然后加入100 μl PBS重悬，加入等体积的碘化丙锭染液低温(4 ℃)混合，尼龙膜过滤，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化。

1.5 Transwell实验检测细胞侵袭

转染48 h后，将细胞在Transwell小室里的上层进行铺板，下层加入RPMI-1640+10%FBS培养基600 μl，把Transwell小室放进24孔板里，培养24 h后取出Transwell小室，多聚甲醛固定并用结晶紫染色，计数迁移距离与过膜细胞比例。

1.6 Western blot检验Bcl-2、MMP-9表达

转染48 h后，提取将细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。上样20 μg蛋白后，SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜，封闭之后添加一抗(1∶1000)，在4 ℃温度下过夜。进行30 min的TBST洗膜，添加二抗(1∶5000)在室温下1 h孵育，30 min洗膜，添加ECL发光剂，实施电脑扫描发光。

1.7 统计方法

所有实验都重复3次，通过应用软件SPSS 19.00展开数据分析，采用均数±标准差来描述计量数据，采用卡方分析与t检验进行组间对比，通过LSD-t法或方差分析来多组对比，检验水准为ɑ=0.05。

2 结果

2.1 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶表达情况对比

si-GnT组的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶表达量显著低于siNC组与空白组(P<0.05)，siNC组与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 三组N-乙酰氨基葡萄糖转移酶相对表达情况对比

2.2 细胞增殖情况对比

转染48 h后，si-GnT组的活细胞比例显著低于siNC组与空白组(P<0.05)，siNC组与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 细胞周期情况对比

相对于空白组与siNC组，si-GnT组的G2/M期比例显著增加(P<0.05)，G0/G1期比例显著降低(P<0.05)。见表3。

表2 三组细胞增殖情况对比

表3 三组细胞周期情况对比

2.4 细胞迁移与侵袭情况对比

si-GnT组的48 h迁移距离与过膜细胞比例都显著少于空白组与siNC组(P<0.05)，siNC组与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 三组细胞迁移与侵袭情况对比

2.5 Bcl-2、MMP-9表达情况对比

相对于空白组与siNC组，si-GnT组的Bcl-2、MMP-9蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 三组细胞Bcl-2、MMP-9蛋白相对表达量

3 讨论

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤之一，见于50～60岁的妇女。研究发现卵巢癌的危险因素包括家族史、不孕、未生育等[7]。由于缺乏早期症状和特异的检查手段，大多数患者检出时已是晚期，为此早期诊断与治疗是改善卵巢癌患者预后的关键[8]。流行病学明确化学、物理、生物、遗传的因素可以导致卵巢癌的发生，涉及到多步骤、多因素、多基因的异常表达与发生[9-10]。

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在多种恶性肿瘤中都有表达，但其在不同肿瘤中的作用各不相同。有学者研究显示N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达水平高提示膀胱癌恶性程度低，分化较好[11]；而在结肠癌中的高表达提示不良预后[12]。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶还能结合钙粘蛋白上的糖基化位点，增加肿瘤细胞的迁移能力；其也能促进血管的生成，但是与期催化活性没有相关性[13]。本研究显示si-GnT组的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶表达量显著低于siNC组与空白组(P<0.05)，siNC组与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)；转染48 h后，si-GnT组的活细胞比例显著低于siNC组与空白组(P<0.05)，siNC组与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)，表明抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达可降低细胞的增殖活动。

细胞周期的调控机制指的是在有关基因控制下，按照特定规则对细胞的生理周期进行调控，细胞周期调控失常与卵巢癌的发生密切相关[14]。细胞周期活动当中有两个重要关键点，即G1/S、G2/M转换，正负向调节物的表达与功能异常跟卵巢癌的生物学特性与异常增殖存在密切关系[15]。基础研究发现N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的产物能和半乳糖结合形成N-乙酰氨基乳糖，进一步形成聚乳糖胺，而该结构是半乳糖凝集素的高度亲和配体；其抑制表达可抑制卵巢癌的增殖，也能促进G2/M期比例增加[16]。本研究显示相对于空白组与siNC组，si-GnT组的G2/M期比例显著增加(P<0.05)，G0/G1期比例显著降低(P<0.05)。而且N-乙酰氨基葡萄糖转移酶能够对c-Myc诱导S期转换产生促进作用，跟c-Myc一起对肿瘤的发生及增殖产生作用[17]。

如果细胞周期运行不正确，那么细胞就会自主进行无限制分裂及增殖，导致侵袭性增加。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶主要催化N.乙酰葡萄糖胺转移到N-糖链上，癌基因与转录因子能结合这些位点，从而调控催化产物的表达水平，而N-乙酰氨基葡萄糖转移酶也可以反过来影响癌基因及其产物，从而对肿瘤的发生发展产生作用[18]。有学者对比了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶高表达和低表达的口腔鳞状细胞癌患者，发现高表达N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的患者5年生存率较低，预后较差，肿瘤侵袭能力较强[19]。本研究显示si-GnT组的48 h迁移距离与过膜细胞比例都显著少于空白组与siNC组(P<0.05)，siNC组与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)，表明抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达可抑制肿瘤细胞侵袭。

已有研究发现Bcl-2、MMP-9等的过度表达可以导致产生肿瘤细胞的凋亡抑制和无限制生长，Bcl-2、MMP-9过表达的细胞系显示出更强的肿瘤形成能力和更强的肿瘤侵袭性[20]。Bcl-2、MMP-9在许多种性肿瘤中异常高表达，虽然其促进肿瘤进展的机制并不清楚，但可能与基底膜的降解、抑制肿瘤细胞自发性凋亡、肿瘤新生血管的形成等因素有关[21]。本研究显示相对于空白组与siNC组，si-GnT组的Bcl-2、MMP-9蛋白表达量显著降低(P<0.05)，表明抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达可抑制Bcl-2、MMP-9的表达。不过N-乙酰氨基葡萄糖转移酶对肿瘤的调控作用是一个多因素多步骤的过程，除了转录因子外，miRNA、组蛋白修饰、DNA甲基化、核苷酸糖代谢位等因素都可能在其中发挥了相应的作用，将在下一步继续明确N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的作用机制。

总之，抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达可以抑制卵巢癌细胞A2780的增殖与侵袭，导致G2/M期阻滞，其作用机制可能与抑制Bcl-2、MMP-9表达有关。