响应面法优化益生发酵剂接种发酵香肠工艺

曹辰辰，冯美琴，孙 健,*，徐幸莲，周光宏

（1.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；2.金陵科技学院动物科学与技术学院，江苏 南京 210038）

发酵香肠是指将绞碎的肉、动物脂肪、盐、糖、发酵剂和各种香辛料等混合之后灌进肠衣，经过微生物发酵、干燥和成熟而形成的具有稳定微生物特性和典型发酵风味的肉制品[1]。传统中国香肠以其独特的风味、香气、质地和口味而深受消费者的喜爱。经过冬季长时间自发发酵，然后在室温下成熟数周，使得中国传统香肠具有特别的浓郁风味和良好质地[2]。然而，由于自然成熟既耗时又受气候限制，且若在某一生产环节出现意外，而使其他细菌成为优势菌，则必然会导致产品质量明显下降，因此许多研究使用添加发酵剂缩短加工时间[3]。目前，国内外用作肉用发酵剂的微生物主要包括乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母和霉菌等[4-6]。

乳酸菌可以通过产生乳酸降低pH值并产生阻止致病性和腐败性微生物生长的细菌素。此外，乳酸菌有助于发酵香肠风味、颜色和质地的发展，并改善肉制品的安全性、稳定性和保质期[7-8]。在香肠发酵和成熟过程中，蛋白质水解和脂肪氧化是最终产品形成良好感官和质地的主要原因[9]。而葡萄球菌由于其具有良好的脂肪酶、蛋白酶、硝酸还原酶等活性，在香肠风味和质地的发展中起重要作用[10]。

在香肠加工过程中，影响其品质的因素有温度，相对湿度，发酵剂种类、配比和接种量等[11-12]。目前，响应面法已被广泛地用于发酵肉制品的工艺优化中[13-15]，但是大多优化发酵香肠的工艺研究都以感官评分作为评价指标，而感官评分对环境和感官人员要求极严格，主观因素对评分结果影响较大。此外，据Shan Liran等[16]报道，近年来在肉类产品的加工中关于健康方面的创新在于减少负面成分或添加健康有益成分。Slima等[17]将益生发酵剂接种发酵牛肉香肠，也有学者[18]使用具有益生特性的植物乳杆菌接种发酵制作萨拉米香肠，而在国内关于使用具有益生特性的发酵剂接种发酵香肠的研究少有报道。因此，本研究以猪肉为原料，添加实验室分离的具有抑菌、耐胃液、耐胆盐等益生特性的植物乳杆菌和模仿葡萄球菌（在实验前进行血浆凝固酶、溶血、耐热核酸酶、生物膜、药敏实验、动物毒理实验等验证其安全性）混合发酵。结合pH值、感官评分、色差和质构的综合结果研究菌种接种量、复配比例和发酵温度对发酵香肠的影响，并以此为基础利用响应面法进一步优化，得到益生发酵剂接种发酵香肠的最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CD101，NCBI编号为MG798695）、模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans NJ201，NCBI编号为MG798671）由本实验分离鉴定所得。

香肠原辅料：猪瘦肉、猪背膘、猪肠衣 江苏省苏食肉品有限公司南京分公司；盐、蔗糖、葡萄糖南通奥凯生物技术开发有限公司；亚硝酸钠 杭州龙山化工有限公司；异抗坏血酸钠 郑州拓洋实业有限公司；姜粉、五香粉、白胡椒粉 市售。

1.2 仪器与设备

TC 12E绞肉机 意大利Sirman公司；VF608灌肠机德国Handtmann公司；KBF 240恒温恒湿箱 德国Binder公司；TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司；CR-400色差仪 日本Konica Minota公司；FE20 pH计美国Mettler Toledo公司；HVE-50自动高压灭菌锅 日本Hirayama公司；SPX-250B-Z生化培养箱 上海博讯实业有限公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团苏州安泰公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂的活化与制备

将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CD101和模仿葡萄球菌Staphylococcus simulans NJ201分别在液体MRS和MSA培养基中37 ℃孵育24 h，活化3 次后，于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤3 次后重悬，菌悬液保留备用。

1.3.2 发酵香肠的制作工艺

1.3.2.1 基本配方

新鲜猪瘦肉与猪背膘质量比为8∶2，其他成分以肉质量为基础添加量：食盐2%、蔗糖1%、葡萄糖1%、亚硝酸钠0.015%、异抗坏血酸钠0.05%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%，发酵剂根据试验设计添加。

1.3.2.2 工艺流程[1]

原料肉→漂洗→绞肉→低温腌制→搅拌→灌肠→恒温发酵→干燥成熟

1.3.2.3 工艺要点

选择新鲜猪后腿肉和猪背膘，将其表面的筋膜和大的筋腱等部位剔除后进行漂洗；将猪背膘切成长约8 cm、宽约3 cm的薄片置于-20 ℃进行预冻，将瘦肉切成长、宽、高均为4～5 cm的肉块后和提前预冻好的背膘一同使用绞肉机搅碎（筛板孔径为10 mm），按照瘦肉与背膘质量比8∶2进行混合备用；按照比例加入各种调味料和辅料并搅拌均匀，置于4 ℃腌制24 h；加入提前制备的发酵剂，搅拌均匀后进行灌肠。灌肠时要掌握合适的松紧度，既不能灌得过于饱满而胀破肠衣，也不能灌得过松导致肠体松散；灌肠结束后进行排气，用温水快速漂洗香肠表面；将处理好的香肠晾挂在恒温恒湿箱中，在30 ℃、相对湿度80%的条件下发酵24 h后，移入15 ℃、相对湿度75%的恒温恒湿箱3 d以减缓发酵，最后12 ℃、相对湿度72%干燥成熟17 d得到成品。

1.3.3 最适发酵时间的确定[19]

采用107CFU/g接种量接种发酵香肠，发酵剂菌种配比为植物乳杆菌-模仿葡萄球菌（以下同）1∶1、温度30 ℃、相对湿度80%、发酵48 h。分别发酵0、6、12、18、24、36、48 h测定香肠pH值，以确定最适发酵时间。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 接种量对发酵香肠的影响

分别采用104、105、106、107、108CFU/g接种量接种发酵香肠，发酵剂菌种配比为植物乳杆菌-模仿葡萄球菌1∶1、发酵温度30 ℃、相对湿度80%、发酵24 h。分别在发酵0、6、12、18、24 h测定香肠pH值，于香肠发酵成熟后对每组香肠的质构、色差进行测定，并进行感官评分。

1.3.4.2 菌种配比对发酵香肠的影响

分别采用发酵剂菌种配比为植物乳杆菌-模仿葡萄球菌1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1接种发酵香肠，选择接种量107CFU/g、发酵温度30 ℃、相对湿度80%、发酵24 h，测定指标同1.3.4.1节。

1.3.4.3 发酵温度对发酵香肠的影响

分别在20、25、30、35 ℃发酵香肠，接种量107CFU/g，发酵剂菌种配比为植物乳杆菌-模仿葡萄球菌1∶1、相对湿度80%、发酵24 h，测定指标同

1.3.4.1 节。

1.3.5 响应面试验

根据Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6软件以感官评分为响应值，进行3因素3水平共17 个试验点响应面试验[20]。用所得数据拟合多元方程，并通过方差分析、回归模型拟合度检验、响应面分析，以确定最优的发酵工艺参数，因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded and corresponding actual levels of independent variables used in response surface design

1.3.6 香肠pH值的测定

按照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》[21]规定的方法用pH计测定。

1.3.7 色差测定[22]

剥去香肠样品肠衣，将肉绞碎混匀，按压成直径2 cm，厚度约1 cm的薄片，选取6 个不同的位置，使用色差仪测定样品的亮度值（L*）、红度值（a*）、黄度值（b*）。使用前用标准版Y=94.0、X=0.315 6、y=0.332 1校正。由于b*会对红色造成较大的影响，因此引用E*评价香肠的色泽以减少误差，E*=a*/b*+a*/L*[23]。

1.3.8 质构分析[24]

剥去香肠肠衣，用双面刀将香肠切成高25 mm直径约20 mm大小，使用P/50A探头，机器参数设定为：50 kg load cell，测前速率2.0 mm/s，测试速率5 mm/s，测后速率5 mm/s，50%压缩率。测定结果取硬度、黏聚性、弹性、咀嚼性4 个指标。

1.3.9 感官评定

感官评定由12 名食品专业人员（6 男6 女）组成的感官评定小组完成，小组成员按照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》进行培训。样品采用随机3 位数编号，评定小组成员要求对所有样品进行评分，评定不同样品时被要求用温水漱口以减少不同样品带来的影响，评定时互不交流。感官评分标准见表2，评分内容包括颜色、气味、组织状态和滋味，所占权重分别为20%、20%、30%、30%。根据分数高低对各组香肠进行质量分级。特级产品87 分及以上，一级产品为80～87 分，二级产品为70～80 分，62～70 分为可接受与不可接受临界，低于62 分为不可接受。

表2 发酵香肠感官评分标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented sausages

1.4 数据处理

每个处理设置6 个重复，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计与分析，数据采用SAS 9.1软件中的Duncan's Multiple-Range Test进行显著性分析，P＜0.05，表示差异显著，P＜0.01，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 最适发酵时间的确定

图1 不同发酵时间香肠pH值的变化Fig. 1 Effect of fermentation time on pH value of fermented sausages

如图1所示，随着发酵时间的延长，pH值不断下降，从12 h开始下降速率明显增大，至24 h时pH值降至4.80，发酵36 h后pH值开始趋于稳定，至发酵48 h降至4.06 h。30 ℃发酵时，pH值必须在48 h内降低到5.3以下才能确保香肠的食用安全性[25]。由图1可知，发酵18 h时pH值降至5.18，考虑到在香肠后期的成熟过程中pH值会回升[26]，而发酵36 h和48 h时香肠的pH值又过低，导致香肠偏酸，不符合消费者口味，因此选择发酵时间为24 h。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 接种量对发酵香肠的影响

2.2.1.1 接种量对香肠pH值的影响

图2 接种量对发酵香肠pH值的影响Fig. 2 Effect of inoculum amount on pH value of fermented sausages

如图2所示，随着接种量的增大，香肠发酵产酸速率增快。以104CFU/g和105CFU/g为接种量时，在发酵的初始阶段pH值基本无变化，直至12 h后才有所下降，24 h后pH值分别为5.63和5.50。接种量为106、107、108CFU/g时，发酵6 h左右时pH值下降速率开始增大；发酵12 h后pH值下降迅速，此时发酵剂开始成为优势菌进行发酵；发酵24 h后pH值分别达5.13、4.80、4.26。发酵剂的存在和代谢活动对香肠的生产至关重要，其中乳酸菌通过糖发酵产生乳酸从而降低肉制品的pH值，从而保证最终产品的稳定性和安全性[27]。104CFU/g和105CFU/g两组由于接种量较低，产品中乳酸菌活菌数少导致产酸较慢、发酵不充分，pH值未降至5.3以下不能较好地确保安全性，并且发酵香肠缺乏固有的酸味。而接种量为108CFU/g时，大量的乳酸菌产酸使得pH值下降的过低，会导致香肠酸味过于浓烈，因此接种量为107CFU/g较为合适，这与张凤宽等[19]研究结果一致。Chen Xi等[28]也报道使用类植物乳杆菌和木糖葡萄球菌以107CFU/g接种量混合发酵制作香肠。

2.2.1.2 接种量对香肠色差的影响

由表3所知，不同处理组之间的L*和a*差异显著（P＜0.05），随着接种量的增大，L*逐渐降低，这可能由于接种量越大，葡萄球菌产生脂肪酶越多，加速脂肪氧化，使得肌肉光泽逐渐消失，切面暗淡[29]。而接种量为107CFU/g时，a*和E*均显著高于其余处理组（P＜0.05），因此接种量为107CFU/g较为合适。

表3 接种量对发酵香肠色差的影响Table 3 Effect of inoculum amount on color parameter values of fermented sausages

2.2.1.3 接种量对香肠质构的影响

表4 接种量对发酵香肠质构的影响Table 4 Effect of inoculum amount on textural properties of fermented sausages

由表4可知，随着接种量的增加，香肠样品的硬度和咀嚼性逐渐增大。接种量为104CFU/g和105CFU/g时，上述指标的测量值大都显著低于其余处理组（P＜0.05），说明接种量对产品的硬度、弹性、黏聚性、咀嚼性影响很大，此时香肠的各项指标较差。成熟过程中，硬度、弹性、黏聚性、咀嚼性的増加是因为含水量及pH值的降低，较低的pH值使肉蛋白质变性，水合能力下降，从而提高产品品质[30]，而接种量为108CFU/g时pH值最低，因此该组硬度最大。接种量为107CFU/g时，黏聚性显著高于其余4 组（P＜0.05），弹性和咀嚼性为最大值，且硬度仅次于108CFU/g组，综合4 项指标结果得出接种量为107CFU/g时最优。

2.2.1.4 接种量对香肠感官评分的影响

表5 接种量对发酵香肠感官评分的影响Table 5 Effect of inoculum amount on sensory score of fermented sausages

如表5所示，结合表4结果可知，接种量为104CFU/g和105CFU/g两组的香肠品质显著低于其余3 组（P＜0.05），而107CFU/g组在颜色、气味、滋味与总分均显著高于其余各组，虽然组织状态与106CFU/g差异不显著（P＞0.05），但是仍高于该组，因此为最优组。同时发现质构结果与感官评分相关性较好，说明质构分析可以相对客观地对香肠实用品质进行评价，从而避免人为因素对评价结果的主观影响。

综合pH值、色差、质构分析和感官评分4 个指标得出，104CFU/g和105CFU/g两组的香肠品质明显较差，而107CFU/g组为最优。

2.2.2 菌种配比对发酵香肠的影响

2.2.2.1 菌种配比对香肠pH值的影响

图3 菌种配比对发酵香肠pH值的影响Fig. 3 Effect of ratio between two strains on pH value of fermented sausages

由图3可知，不同处理组pH值变化趋势基本一致，其中植物乳杆菌-模仿葡萄球菌3∶1组从12 h开始pH值大幅下降最终降至4.23，这是由于该组乳酸菌的比例最高，因此产酸速率最快。配比为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3处理组最终pH值分别降至4.56、4.81、4.69、4.63，5 组香肠pH值均降至5.3以下，可以较好地保证香肠的安全性，但pH值过低时香肠酸度较大，不容易被消费者所接受，因此配比为1∶1时最优，这与杨秀娟等[31]在香肠工艺优化中得出的最佳条件为植物乳杆菌与戊糖片球菌的比例1∶1结果一致。

2.2.2.2 菌种配比对香肠色差的影响

表6 菌种配比对发酵香肠色差的影响Table 6 Effect of ratio between two strains on color parameter values of fermented sausages

由表6所知，随着发酵剂中植物乳杆菌比例的上升，香肠的亮度不断下降，红度不断增大。1∶1组与2∶1和3∶1组E*值差异不显著（P＞0.05），但数值大于其余4 组，综合考虑菌种配比为1∶1时香肠的色泽最佳，这与李静雯等[32]研究发酵剂配比对香肠色差的影响结果一致。此外，Slima等[17]报道使用益生发酵剂接种发酵香肠，降低香肠的b*和蒸煮损失，提升香肠的色泽。

2.2.2.3 菌种配比对香肠质构的影响

表7 菌种配比对发酵香肠质构的影响Table 7 Effect of ratio between two strains on textural properties of fermented sausages

由表7可知，不同处理组之间各项指标差异较大，说明发酵剂配比对香肠品质影响较大。发酵剂配比为3∶1和1∶3组的各项指标均显著低于其余3 组，香肠品质较差。菌种配比为1∶1时，虽然4 项指标均与2∶1处理组差异不显著（P＞0.05），但具体值均为5 组之中最大，综合品质最佳。

2.2.2.4 菌种配比对香肠感官评分的影响

表8 菌种配比对发酵香肠感官评分的影响Table 8 Effect of ratio between two strains on sensory score of fermented sausages

如表8所示，不同组之间总分差异显著（P＜0.05），说明菌种配比对香肠感官评分影响较大。结合表6、7结果可知，发酵剂菌种配比为1∶1和2∶1时，香肠的质构、色差、感官评分均优于其余3 组。同时质构、色差结果与感官评分相关性较好，综合对比更客观反映香肠品质的好坏。

综合pH值、色差、质构和感官评分4 个指标得出，发酵剂菌种配比1∶1时为最优组，此时菌种的产酸能力适当，香肠pH值在一定程度上的降低可促进蛋白质降解，使产品滋味得到改善，这与Mangia等[33]使用植物乳酸菌和木糖葡萄球菌配比为1∶1接种发酵香肠结果一致。

2.2.3 发酵温度对发酵香肠的影响

2.2.3.1 发酵温度对香肠pH值的影响

图4 发酵温度对发酵香肠pH值的影响Fig. 4 Effect of fermentation temperature on pH value of fermented sausages

由图4所知，随着发酵温度的升高，香肠发酵产酸速率增大。20 ℃和25 ℃两组随着发酵时间的延长，缓慢下降，最终pH值降至5.62和5.43，未达到5.3以下；30 ℃和35 ℃组前12 h的pH值一直缓慢下降，至12 h开始迅速下降，35 ℃处理组下降速率最大，18 h后下降速率又开始减慢，最终分别降至4.82和4.48，这也证实了巩洋[12]报道的乳酸菌低温产酸能力小于高温产酸能力。同时由于35 ℃组pH值降得过低，不易被消费者所接受，综上可知30 ℃处理组最佳，这与潘明等[34]探索羊肉香肠发酵条件的结果一致。

2.2.3.2 发酵温度对香肠色差的影响

表9 发酵温度对发酵香肠色差的影响Table 9 Effect of fermentation temperature on color parameter values of fermented sausages

由表9可知，不同温度下香肠的L*差异显著（P＜0.05），说明发酵温度对香肠的亮度影响较大，随着发酵温度的升高，亮度逐渐降低，这可能是因为肌肉中肌红蛋白含量及化学状态会显著影响肉的色泽，而随着发酵温度的升高，氧合肌红蛋白和肌红蛋白氧化程度加深形成高铁肌红蛋白，导致肉色变暗[17]。20 ℃组a*最小，b*最大且显著高于其余3 组，故E*显著低于其余3 组，在4 组香肠中色泽最差。30 ℃处理组的E*与35 ℃组差异不显著（P＞0.05），但高于35 ℃组，因此选择30 ℃处理组为最优组。

2.2.3.3 发酵温度对香肠质构的影响

表10 发酵温度对发酵香肠质构的影响Table 10 Effect of fermentation temperature on textural properties of fermented sausages

由表10可知，随着发酵温度的升高，香肠的硬度和咀嚼性逐渐增大，这是由于低温不利于乳酸菌的生长，而在适宜温度时乳酸菌大量繁殖迅速产酸，导致香肠水分含量降低，增加产品硬度和咀嚼性[30]。20 ℃各指标大都显著低于其余组（P＜0.05），综合品质最差。30 ℃和35 ℃两组各项指标差异均不显著（P＞0.05），但显著高于其余2 组。

2.2.3.4 发酵温度对香肠感官评分的影响

表11 发酵温度对发酵香肠感官评分的影响Table 11 Effect of fermentation temperature on sensory score of fermented sausages

如表11所示，30 ℃组的颜色和滋味与35 ℃差异不显著（P＞0.05），但气味、组织状态和总分显著高于35 ℃组（P＜0.05），这可能是因为pH值是影响酶活性的重要因素，而较低的pH值能通过抑制肉中蛋白酶和脂肪酶的活性，从而对香肠最终风味产生不利影响[35]，而35 ℃组香肠的酸度较大，导致总分较低。

综合pH值、色差、质构分析和感官评分4 个指标得出，发酵温度为30 ℃时香肠品质最佳，Chen Xi等[28]也报道在使用干酪乳杆菌和木糖葡萄球菌发酵香肠时发酵温度为30 ℃。

2.3 响应面试验结果与分析

2.3.1 响应面优化试验结果及方差分析

表12 响应面试验设计方案及结果Table 12 Experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert V8.0.6软件中的Box-Behnken原理设计试验，试验组合和结果如表12所示。以接种量A、菌种配比B、发酵温度C为自变量，以感官评分Y为因变量，得到的二次多项方程为：Y=-499.520 36+125.846 50A+11.819 34B+9.269 03C+0.680 00AB-0.150 00AC+0.072 105BC-8.837 25A2-6.880 33B2-0.135 99C2，R2=0.967 3，校正系数R2Adj=0.925 3，表明响应值变化的96.73%能用该模型解释，精密度为12.790大于4，表明该回归模型拟合程度较佳。

回归方差分析结果如表13所示，模型极显著（P＝0.000 2＜0.01）；失拟项不显著（P＝0.661 9＞0.05），因此模型建立有效；香肠感官评分的因子主次顺序为：接种量＞菌种配比＞发酵温度，且A2、B2、C2对模型影响极显著（P＜0.01）。

表13 感官评分响应面方差分析结果Table 13 Analysis of variance for response surface regression model

2.3.2 各因素间交互作用分析

图5 交互作用对发酵香肠感官评分影响的响应面图Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effects of fermentation conditions on sensory score

从图5可以看出，香肠感官评分随着接种量、菌种配比、发酵温度的变化出现先升高后降低的趋势。接种量、菌种配比和发酵温度两两之间对香肠感官评分的交互作用不显著，尤其菌种配比与发酵温度对香肠感官评分交互作用的等高线图接近圆形，交互作用不显著。综上所述，使用发酵剂制作发酵香肠的最佳工艺参数为接种量6.91（lg（CFU/g））、植物乳杆菌-模仿葡萄球菌配比1.16∶1、发酵温度30.43 ℃，此时香肠的感官评分最高，为85.43。

2.3.3 验证实验结果

考虑到实际操作的可行性，将得到的最佳工艺参数条件调整为接种量107CFU/g、菌种配比1∶1、发酵温度30 ℃，重复3 次进行验证。最终得到产品的感官评分平均值为85.28，与模型理论值相近，说明该模型能较好地用于优化发酵香肠的制备工艺。

3 结 论

本实验通过pH值、色差、质构和感官评价的结果探究发酵剂接种量、菌种配比和发酵温度对发酵香肠品质的影响。对接种量的分析表明，接种量对香肠pH值、色泽、质构中的硬度和咀嚼性等均影响较大，不同组之间差异显著，综合评定为107CFU/g最优；对菌种配比的分析表明，配比对于香肠的pH值、色泽、质构等影响相比接种量较弱，部分组间差异不显著，最终结合感官评分得出配比为1∶1时最优；对发酵温度的分析表明，发酵温度对于香肠pH值降低速率影响显著，而对于香肠的色泽和质构等影响较弱，30 ℃和35 ℃两组间差异不显著，但最终结合感官评分结果得出30 ℃最优。结合以上单因素试验结果利用响应面优化试验进行进一步分析，得到发酵香肠最佳工艺参数为接种量107CFU/g、菌种配比1∶1、发酵温度30 ℃，此时香肠的感官评分为85.28。验证实验表明本研究建立的模型能较好地用于优化发酵香肠的制备工艺。此发酵条件制作的发酵香肠硬度适中、肠体坚实有弹性、质地紧密、切片界面清晰、酸味纯正、后味饱满、余味浓烈且无刺激性、具有浓郁的发酵香味、色泽好口感佳，符合我国消费者习惯，表明本研究最终确定的工艺可行度高。