返魂草药材提取方法考察与特征图谱建立

王春驰，周婷婷，纪圣君，朱迪夫，姜瑞芝，高其品,2*

（1.吉林省吉测检测技术有限公司，长春 130117；2.长春中医药大学，长春 130117；3.吉林益民堂制药有限公司，吉林 四平 136001）

返魂草（Senecio cannabifolius Less.）为菊科千里光属多年生草本植物，以其为原料的制剂如返魂草颗粒（肺宁颗粒）具有清热祛痰，镇咳平喘之功效。市场已有多家企业生产该成药，临床广泛用于治疗肺内感染，慢性支气管炎，喘息性支气管炎，急性呼吸道感染等[1]。已有大量文献报道，返魂草的主要活性成分为有机酸和黄酮类，两类成分均显示出多种生物活性[2-7]。目前，对返魂草药材指纹图谱的研究的也有报道[8]，但提取方法暂无水煎-醇超声法，因此，本研究对返魂草提取方法进行考察，以获得成分信息反映更加完整的HPLC谱图，同时，也对色谱条件进行优化，结果显示Agilet Zorbax SB-C18色谱柱（4. 6 mm×250 mm，5-Micron）分离效果最好，乙腈-0.1%三氟乙酸溶剂系统为流动相的色谱峰分布、分离度较好，检测波长为330 nm色谱峰最多，响应值较高。最后研究建立了返魂草HPLC对照特征图谱并确定8个特征峰的相对保留时间，为该药材的质量控制研究提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器 LC-2030C 3D高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BSA224S-CW型电子天平（德国塞多利斯公司）；KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TD5A-ws离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 实验试剂 甲醇、乙腈（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；三氟乙酸（长春三邦医药科技有限公司）；绿原酸对照品（110753-201716）、金丝桃苷对照品（11521-201708）、异槲皮苷（11809-201403）（中国食品药品检定研究院）；新绿原酸（B21396）、隐绿原酸（B21587）、异绿原酸A（B21539）、异绿原酸B（B21540）、异绿原酸C（B21541）（上海源叶生物科技有限公司）。共收集了不同产地的返魂草样品4份，由吉林益民堂制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 提取方法考察

2.1.1 水煎法 取药材粉末（过四号筛）2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水50 mL，称定质量，煎煮1 h，适时摇晃补水，放冷，再称定质量，以水补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2 醇超声法 取相同药材粉末置锥形瓶中，精密加入质量分数为70%的甲醇25 mL，称定质量，超声处理1 h（功率500 W，频率40 kHz），放冷，用质量分数为70%的甲醇补足减失质量，摇匀，离心，精密量取上清液2.5 mL置10 mL量瓶中，用质量分数为70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.3 水煎-醇超声法 取相同药材粉末至锥形瓶中，精密加水50 mL，称定重量，煎煮1 h，适时摇晃补水，放冷，称定重量，以水补足减失的重量，摇匀，精密加甲醇50 mL，称定重量，超声处理1 h（功率500 W，频率40 kHz），放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，离心，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.4 考察结果 图1为水煎法、醇超声法和水煎-醇超声法提取返魂草药材的HPLC图谱，对比可发现，通过水煎法提取返魂草药材其HPLC图谱中4、5、6、7、8号峰较小，醇超声法提取的返魂草药材其HPLC图谱中1、3、6号峰较小，而通过水煎-醇超声法提取的样品其HPLC图谱中可以看出8个成分的转移率均有较大的提高，使整个图谱呈现指纹性，更具有信息完整性。故选择水煎-醇超声法作为返魂草药材提取方法从而建立返魂草药材HPLC特征图谱。

图1 三种方法提取返魂草药材的HPLC图谱

2.2 色谱条件 Agilet Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5-Micron），流动相为乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）溶剂系统，梯度洗脱（0～25 min，8%～18% A，25～ 50 min，18% ～ 22 % A，50～ 55 min，22%～8% A，55～60 min，8%～8% A），柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，检测波长330 nm。进样量10 μL。

2.3 溶液配制

2.3.1 供试品溶液的制备 取药材粉末（过四号筛）2.0 g，精密称定，至锥形瓶中，精密加水50 mL，称定重量，煎煮1 h，适时摇晃补水，放冷，再称定重量，以水补足减失的重量，摇匀，精密加甲醇50 mL，称定质量，超声处理1 h（功率500 W，频率40 kHz），放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，离心，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3.2 参照物溶液的制备 取绿原酸对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含20 µg的溶液，即得。

2.3.3 混合对照品溶液制备 分别取对照品新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C适量，分别加50%甲醇制成每1 mL含20 µg的溶液，得混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，分别于供试品溶液制备后第0、4、8、12、16 h进样，以2号峰为参照峰（S），计算各特征峰相对保留时间和峰面积的RSD范围分别为0. 41%～0. 52%，0.08%～1.60%。表明供试品溶液在制备后16 h内稳定。

2.4.2 精密度试验 精密吸取相同供试品溶液，连续进样6次，以2号峰为参照峰（S），计算各特征峰相对保留时间和峰面积的RSD范围分别为0.04%～0.10%，0.10%～0.30%表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取相同样品粉末6份，按2.3.1中方法处理，得供试品溶液，分别进样，记录特征图谱，以2号峰为参照峰（S），计算各特征峰相对保留时间和峰面积的RSD范围分别为0. 21%～0. 48%，0.18%～1.15%表明该方法的重复性良好。

2.5 返魂草药材的HPLC特征图谱的建立 按2.2方法记录4个不同产地返魂草药材0～60 min HPLC特征图谱。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）生成对照特征图谱，建立返魂草HPLC对照特征图谱，通过与对照品图谱比对（见图2），指认1号峰为新绿原酸、2号峰为绿原酸、3号峰为隐绿原酸、4号峰为金丝桃苷、5号峰为异槲皮苷、6号峰为异绿原酸B、7号峰为异绿原酸A 、8号峰为异绿原酸C（见图3）。

2.6 特征峰相对保留时间的确定 返魂草HPLC特征图谱有8个特征峰，其中2号峰为绿原酸，峰面积相对较大，重复性好，作为参照峰（S），依据2015年版《中国药典》关于中药特征图谱的规定，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，在规定值的5%。将相对保留时间的平均值作为规定值，分别为：0.67（峰1）、1.00（S峰）、1.08（峰3）、2.11（峰4）、2.18（峰5）、2.52（峰6）、2.69（峰7）、3.07（峰8）8个特征峰相对保留时间，见表1。

图2 对照品图谱

图3 返魂草药材的HPLC对照特征图谱

3 讨论

目前返魂草相关研究报道中多采用醇超声法和索氏提取法[9-13]作为返魂草药材提取方法，本研究首次选用水煎-醇超声法提取返魂草药材并建立了HPLC特征图谱，该提取方法简便且灵敏度高，特征性成分信息完整，可用来全面评价和监测返魂草药材的质量。本次研究采集了4个产地的返魂草样品来考察提取方法进而建立HPLC特征图谱并确定特征峰相对保留时间，并不能充分的体现返魂草化学成分的特性，还有待采集更多样品进行分析。