多重PCR技术在病原微生物检测中的应用

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(1.四川东方主食产业技术研究院,四川成都 611130; 2.四川省食品发酵工业研究设计院,四川成都 611130)

传统PCR技术(聚合酶链式反应,polymerase chain reaction)应用非常普遍,然而假阳性污染和定量准确度等问题限制了传统PCR检测技术的进一步应用。现今社会引起人类、动物中毒、感染和患病的病原微生物依然层出不穷,这要求病原微生物的检测需更加及时准确、特异高效。随着生物技术的快速发展,在一个反应体系中进行多个靶位点扩增的多重PCR技术(Multiplex PCR,MPCR)已广泛应用于病原微生物检测[1-5]等方面的研究,取得了较好的成效。

本文对多重PCR技术原理及其在病原微生物(人类、动物疾病、农作物病害、食源性致病菌等)中的最新应用进展进行了阐述,提出了存在的问题及解决措施,并对其应用前景进行了展望,以期为多重PCR技术的进一步应用提供一定的参考依据。

1 多重PCR技术原理

多重PCR技术是基于单一PCR技术进行优化改进的一种新技术,其较传统PCR技术效率更高、产率更高、灵敏度更高、特异性更强、更加经济方便等[6]。它将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带,或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断,常用于对超长片断的扩增。在体外条件下,将双链DNA热变性成单链DNA,以一条单链DNA为模板,单链DNA靶序列与人工合成的引物结合,在4种碱基dNTPs底物和DNA聚合酶作用下,引物沿着DNA单链从5′末端到3′末端方向延伸,合成新的双链,以其作为模板,又重复以上聚合酶反应,合成新的DNA双链,经过20～35个循环特异性扩增出大量拷贝[7]。

2 多重PCR技术在病源微生物检测中的应用

2.1 人类病原微生物的检测

如今快节奏的社会生活要求各种病源微生物的检测、应急处理及临床诊断更加及时准确。

阳波等[8]建立的初步筛查和快速检测389份腹泻患者中弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)的四重PCR方法的检测下限可达32 CFU/反应(8.01×103CFU/mL)。在检测病毒和不典型病原体在儿童下呼吸道感染(LRTI)病原中的分布中,多重PCR技术与直接免疫荧光法对相同病原检出一致,但多重PCR技术病毒的检出率更高,这更加有助于全面了解儿童LRTI的病原[9]。

此外,陈信良等[10]对医院62例呼吸道感染患者的标本进行多重PCR扩增检测,检出阳性29例(阳性率46.8%),其中以流感病毒为主,占病毒阳性检出48.3%,两种或两种以上病毒混合感染5例。这也不仅验证了该技术能用于快速检测呼吸道标本,同时也在一定程度上说明可能多重PCR技术对病毒的检测敏感度较高,可为急性病毒性呼吸道感染的常规检测、应急处理及临床诊断提供快速检测手段和更多的病原学依据。

另外,在儿童血流感染常见病原菌检测方面,黄君华等[11]建立的多重PCR方法结果表明,180例血液样本中血培养法的阳性率为7.8%,而多重PCR方法阳性率为13.9%,明显高于血培养法,且将病原菌鉴定到种提前3～5 d,这对临床及时合理用药具有重要的指导意义。

多重PCR技术对诊断人类常见病原微生物具有高检出率和高效性,可尝试检测更多的病原体,以加快应用该技术,为人类病原微生物的检测提供更加及时的帮助。

2.2 动物病原微生物的检测

多重PCR技术在畜禽病原诊断应用方面同样已有较多的研究,且效果显著。Zhang等[12]建立的与牛呼吸道疾病综合症(BRDC)密切相关的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼海姆氏菌和化脓性真菌3种病菌的多重PCR方法,对3种病菌基因组DNA的检测限为40 pg/μL,加速实验室诊断和指导治疗BRDC。丁天翊等[13]建立的多重PCR方法具有较好的特异性和敏感性,对牛乳房炎4种主要致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及白色念珠菌的敏感度分别为102、104、105和102CFU/mL。另外如表1,针对山羊、绵羊、猪、鸡致病微生物检测建立的多重PCR方法,虽与细菌分离培养鉴定结果一致,但较传统方法更加快速、准确度更高、特异性更强。

表1 动物病原微生物的检测Table 1 The detection of animal pathogenic microorganisms

2.3 农作物病原微生物的检测

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌是严重危害水稻抽穗的两种病菌,可能会影响稻米产量。这两种菌在形态性状和分子遗传学等方面都极其相似,常规检测方法很难及时有效的对其分离鉴定。岳凯等[18]建立的多重PCR体系对细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的检测灵敏度分别为104、105CFU/mL,节省了细菌DNA提取,可对两种病菌精准、快速检测。同时,李云飞等[19]建立的多重 PCR技术也实现了对不同国家的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌进行同时准确检测。

大豆根腐病是影响大豆减产的重要病害,由多种镰孢菌引起。不同地区的致病镰孢菌群体存在一定差异,而传统的镰孢菌鉴定方法费时费力且准确度差。基于此,有学者建立了大豆根腐病镰孢菌的多重PCR检测方法,结果表明该法对4种镰孢菌(尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、禾谷镰孢菌和木贼镰孢菌)混合DNA的检测灵敏度达0.1 ng/μL,可对1种或多种大豆根腐病镰孢菌快速、特异检测,且操作简便,成本较低[20]。

2.4 食源性致病微生物的检测

在我国食源性疾病事件中,微生物性食物中毒事件和患者数最多,分别占40.09%和61.92%[21]。大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、阪崎杆菌等食源性致病微生物是食源性疾病发生的主要原因之一。

2.4.1 单一致病微生物的检测 多重PCR技术已广泛用于单一病原微生物检测,且能有效鉴别不同血清型。杜琳等[22]建立了生鲜乳中布鲁氏杆菌的多重PCR检测方法,灵敏度可达105CFU/mL。Ryu等[23]建立的多重PCR技术同时检测肉类食品中6种李斯特氏菌的方法效果十分显著。李云等[24]、李慧等[25]分别建立的快速检测13种金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)和产黄曲霉毒素真菌的多重PCR方法,均可灵敏、特异、快速有效检测SE的基因和产黄曲霉毒素真菌。陈金龙等[26]建立的大肠杆菌O26、O45、O121 3种血清群的多重PCR检测方法检测灵敏度最低可达10 pg细菌基因组DNA。在8种血清型肠出血性大肠埃希氏菌高特异、高灵敏度的同步、快速检测中,多重PCR方法弥补了传统方法耗时费力、步骤繁琐等问题[27]。

2.4.2 多种致病微生物的检测 目前,国内外有很多学者研究利用多重PCR同时检测乳品、肉品、果蔬中多种致病微生物,所建立的多重PCR检测高效快速、敏感度高、特异性强、稳定性好,为食品质量安全的监控提供强有力的依据。

2.4.2.1 乳品致病微生物检测 在奶牛养殖及乳品生产、销售等过程中,牛乳的致病菌污染情况不容忽视,因此需采用高效的方法快速检测和分析致病微生物,特别是在多种致病微生物共同存在的情况下,如何特异、灵敏、准确的鉴别致病微生物显得十分重要。Wei等[28]建立了同时检测培养基和牛奶中的大肠埃希菌O15∶H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等食源性病原体的多重PCR方法,其检测灵敏度为103CFU/mL,检测限与食品样品中的单重PCR法一致,但更加高效。苗小草等[29]建立了四重PCR方法,可同时检出初始菌浓度为1 CFU/mL的4种乳品中检出率较高的食源性致病菌,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的灵敏度分别为10-6、10-2ng/μL,对单核细胞增生李斯特菌、克罗诺杆菌属的灵敏度均达10-3ng/μL。另外,用6种致病微生物(金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠埃氏菌、黑曲霉菌等)污染牛奶样品后,采用多重PCR技术对此6种致病菌的检测限可达1.2 CFU/mL,较Ge XP-PCR技术提高了至少50～350倍,同时该法检测成本较生物传感器和免疫学方法更低,稳定性更好,并可增加同时检测的菌株数[30]。因此,在对乳品中多种常见致病菌的检测上,多重PCR技术从检测灵敏度、菌株数及成本控制上提供了行之有效的解决方法。

2.4.2.2 肉品、果蔬致病微生物检测 针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌3种有害微生物,也有学者建立了可同时快速、灵敏、特异、简便的检测这3种食源性致病菌的多重PCR方法[31]。在果蔬病原菌检测方面,多重PCR方法同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157∶H7时,灵敏度可分别达到2.7×104、3.8×104、3.3×104CFU/g[32]。

2.4.2.3 与传统分离培养方法比较 有学者对多重PCR法和传统分离培养法检测致病菌进行了对比研究(表2)。吴科明等[33]研究表明多重PCR法检出率显著高于传统分离培养法(p<0.05),这对食源性致病菌的及时判定,预防食物中毒具有十分重要的现实意义。冯可等[34]建立的多重PCR方法在鲜切果蔬4种致病菌同时检测时间上较传统分离培养法明显缩短,这对企业或分析检验中心大批量样品的监测具有指导意义。

表2 多重PCR法和传统分离培养方法检测对比Table 2 The comparison between multiplex PCR and traditional isolating culture method

2.5 结合其他方法对病原微生物的检测

采用多重PCR技术结合其他方法来检测病原微生物已有报道。Feng等[35]采用优化的多重PCR系统和叠氮溴化丙锭(PMA)结合的方法检测鲜切哈密瓜中的所有活病原体。结果显示PMA-mPCR对单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度为2.6×103CFU/g,对大肠杆菌O157∶H7的灵敏度为43 CFU/g,对金黄色葡萄球菌的灵敏度为310 CFU/g。同时用不同浓度的3种病原体接种鲜切哈密瓜在富集培养6 h后,病原体的检测灵敏度明显提高到1 CFU/g。这对采用PMA快速处理病原体以有效去除膜不完整细胞的DNA,进而联合mPCR方法快速检测复杂样本中的活菌数量是一个很好的应用实例。

此外,多重PCR技术与SSEL增菌、变性高效液相色谱(DHPLC))等方法联合检测病原微生物的研究也已有报道(表3),其高特异性、灵敏度为多重PCR的联合应用和高效检测提供更多途径。

表3 多重PCR结合其他方法检测病原微生物Table 3 The detection of multiplex PCR combined with other methods on pathogenic microorganisms

3 问题与展望

3.1 存在问题及改善措施

多重PCR方法可快速、准确、灵敏的同时检测多个目的基因或借助其交叉限制进行确认。但其同样存在不足之处,如扩增条件需要探索与协调。多对引物同时扩增,可能出现引物间干扰,且各种试验条件控制不当,引物的设计及靶序列的选择不当都可能降低其灵敏度和特异性,很容易导致扩增失败或非特异性产物。对食品样品进行检测时,增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓慢或被抑制,可能出现假阴性结果;实际应用中有少量外源性DNA污染,可能出现假阳性结果。

在一个PCR反应体系中,不同目的片段的扩增是相互竞争的,引物组合、引物浓度、退火温度等都会影响多重PCR的结果,而反应体积、不同延伸温度、循环次数对其扩增效果影响较小。因此,在应用多重PCR技术检测前,制定严密周详的试验设计是十分重要的。合理设计引物,优化最佳多重PCR体系及反应条件可增加其灵敏度和特异性,减少非特异性扩增、假阴性、假阳性等结果。

3.2 前景展望

多重PCR技术对病原微生物的检测具有适用性、有效性和通用性。随着科技水平和生物技术的进一步发展,多重PCR技术的综合应用已成为一种趋势,其高特异性、高敏感性和简便快速为人类、动物病原微生物、农作物病害、食源性致病微生物等检测提供了准确有效的方法与决策依据,对及时判定和有效控制病原菌传播、预防食物中毒等具有十分重要的现实意义。今后,更加简便、快速、特异的多重PCR检测技术将会得到广泛的应用。