太子参均一多糖对大鼠小肠α-糖苷酶活性影响

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1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122

国内多名学者的研究结果表明太子参多糖具有抗糖尿病作用[1-3]。课题组前期，以闽产柘荣太子参为原料，提取粗多糖，醇沉得到分子量分布不同太子参多糖的四个级分区，并将四个级分区分别对1型及2型糖尿病大、小鼠进行抗糖尿病药效对比实验。结果表明50～200kDa分子量段的多糖可显著降低2型糖尿病大鼠血糖，改善糖尿病一般症状[4]。进而采用DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶柱联用将太子参多糖抗2型糖尿病有效部位进行分级、纯化，获得均一多糖HPH-1-2及HP0.5MSC-F；集成UV、IR、NMR等多种波谱分析技术，表征其化学结构；通过体外细胞实验证明太子参均一多糖PHP0.5MSC-F及PHPH-1-2具有降糖活性[5-6]。本研究从大鼠小肠中分离α-糖苷酶，采用pNPG法、ELISA检测，考察太子参均一多糖对α-糖苷酶活性影响，探讨其降血糖途径[7]。

1 仪器与材料

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠(200±5)g(上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2017-005)；HP0.5MSC-F、HPH-1-2，纯度大于95%。

1.2 试剂 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(批号：BCBH2918V，sigma公司)；磷酸氢二钠(分析纯，批号：20120330，国药试剂)；二甲基亚砜(批号：SHBB9317V，sigma公司)；磷酸二氢钠(分析纯，批号：141121，国药试剂)。

1.3 仪器 YP502N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；AE240S分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DK-420S水浴锅(上海精密实验设备有限公司)；GNP-9080 恒温培养箱(上海精密实验设备有限公司)；UV-3200紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；Varioskan Flas多功能酶标仪(美国热电公司)。

2 方法与结果

2.1 基本原理 由大鼠分离小肠α-糖苷酶，以对硝基酚-α-葡萄糖苷(pNPG)为底物，利用α-葡萄糖苷酶将其分解成pNP及葡萄糖，而pNP在碱性条件下显色的原理测定酶活力[8]。

2.2 实验步骤

2.2.1 磷酸盐缓冲液的配制 精密称取NaH2PO4·2H2O 15.7981 g，Na2HPO4·12H2O 35.7990 g，分别超声溶解，定容至100 mL，混匀，得到1M磷酸盐贮存液。分别取贮存液NaH2PO454 mL，Na2HPO446 mL，定容至1 L，即得pH=6.8 0.1 M磷酸缓冲盐溶液。

2.2.2 酶的提取 大鼠禁食不禁水12 h后，脱颈椎处死，立即取出小肠，用冷生理盐水冲洗，翻转小肠后再漂洗，将洗净的小肠置于培养皿上，用载玻片轻刮下小肠黏膜。加入适量的 4℃ pH=6.8的磷酸盐缓冲液，匀浆后于 4℃，20 000 g/min离心20 min，沉淀加适量的 4℃ pH=6.8的磷酸盐缓冲液摇匀后，20 000 g/min离心20 min ，合并上清液，加磷酸盐缓冲液稀释至20 mL/每只大鼠，置于-20℃保存备用。

2.2.3 底物溶液的配制 精密称取0.015 03 g 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷，加入少量缓冲盐溶液，超声溶解，以缓冲盐溶液定容至25 mL。

2.2.4 阿卡波糖溶液的配制 精密称取阿卡波糖12.86 mg，加DMSO 50 μL超声溶解，纯水定容至10 mL。即得2 000 μmol/L阿卡波糖溶液。去上述溶液500 μL，纯水定容至10 mL。即得100 μmol/L阿卡波糖溶液。

2.2.5 试样对α-糖苷酶抑制率 试验依次将磷酸盐缓冲液、试药入到96孔板内，复孔3孔，37℃孵育10 min，实验组加入30 μL 底物溶液，混匀，37 ℃ 反应30 min后，随后立即测定405 nm吸光度。

2.2.6 药物对α-糖苷酶抑制率的计算方法 将实验各组所得OD值代入下式计算太子参均一多糖对α-糖苷酶抑制率。实验重复3次，所得实验结果以平均值表示。抑制率的计算公式如下：

2.3 结果 当阿卡波糖浓度为55 μmol/L时，其对大鼠小肠α-糖苷酶的抑制率为50.18%，表现出对大鼠小肠α-糖苷酶强抑制活性；HP0.5MSC-F、HPH-1-2、在浓度为400 μmol/L时其抑制率依次为19.00%、27.43%。见表1。

表1 PHP0.5MSC-F和PHPH-1-2对α-糖苷酶的抑制作用 (n=3)

3 讨论

源于饮食的糖类化合物分解代谢是由一系列糖苷水解酶在小肠中完成的，这些酶包括直链淀粉酶、蔗糖酶及乳糖酶；酶水解产物主要为葡萄糖，透过小肠壁主动吸收进入血液循环。对糖尿病人，减少葡萄糖吸收量从而阻抑血糖浓度的快速升高是一条十分重要的治疗途径。阿卡波糖就是糖水解酶抑制剂，阻止餐后血糖升高，疗效确切、副作用小，临床广泛应用；本研究考察太子参均一多糖对大鼠小肠α-糖苷酶活性影响，从一个侧面探讨太子参多糖的降血糖途径。但实验中所用底物pNPG溶液室温下易水解变质，配置后应放于4℃冰箱保存。

本研究以阿卡波糖作为阳性对照，ELSA法检测太子参均一多糖对α-糖苷酶的抑制作用。PHP0.5MSC-F和PHPH-1-2两种太子参均一多糖对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。