回归正交设计对密蒙花总黄酮提取工艺参数优化建模

黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556000

密蒙花为马钱科醉鱼草属植物密蒙花(BuddleiaofficinalisMaxim.) 的干燥花蕾和花序[1]，又称做黄饭花、染饭花、小锦花、鸡骨头花等，是一种常用中药，主要用于目赤肿痛、多泪涩明、目生翳膜、肝虚目暗、视物昏花等症[2]。在贵州黔东南地区，每逢过节有用密蒙花新鲜或干燥花蕾和花序的水浸液染糯米饭食用的习俗。文献报道[3]，密蒙花的主要活性成分为黄酮类、苯乙醇苷类、三萜及其皂苷类化合物，其中黄酮类化合物是密蒙花的主要活性成分之一，现代研究表明[4-5]，密蒙花中的黄酮类成分达11种，具有抗炎、降血糖、免疫调节、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等作用。有关黔东南地区密蒙花中黄酮类成分提取工艺及其在医药行业中利用价值的开发研究比较少，本研究采用二次回归正交试验设计对超声提取密蒙花总黄酮成分的工艺条件进行优化，为密蒙花资源的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 UV8000S紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，洁康超声波清洗器(洁康超声波设备有限公司) ，MS204S型电子分析天平( 梅特勒托利多(上海)仪器有限公司)。

1.2 材料与药品 密蒙花采自黔东南州境内，晒干，粉碎后备用；芦丁标准品(批号：Y19N7S25244，上海源叶生物科技有限公司)，无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 样品总黄酮提取液制备 准确称取密蒙花粗粉1.0 g若干份，置具塞锥形瓶中，加25 mL石油醚，超声提取15 min，滤过，弃去石油醚液，药渣晾干后，按单因素试验及正交组合试验设计方案，加一定倍量和浓度的乙醇，超声提取，将提取液过滤，合并滤液，转移至50 mL容量瓶中，加相应浓度乙醇定容，即得密蒙花总黄酮提取液。

1.3.2 标准曲线的绘制 称取10℃下干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，用无水乙醇溶解并定溶到50 mL容量瓶中，摇匀，得0.2 mg/mL标准溶液。精密吸取上述标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别放入20 mL 的容量瓶中，先各加入5 %NaNO2溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min后，分别加入10 %Al(NO3)3溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min后，再分别加入4 %的NaOH 溶液5 mL，用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，在510 nm 处测定吸光度值。以吸光度A为纵坐标，芦丁标准溶液浓度C(mg/mL)为横坐标， 绘制标准曲线，并拟合芦丁标准曲线的回归方程为： A=0.005+11.892C(r=0. 999) ，表明黄酮在0.000～0.030 mg/mL 范围内与吸光度A呈线性关系，标准曲线如图1所示。

1.3.3 总黄酮含量计算 精密吸取密蒙花总黄酮提取液0.5 mL置于20 mL容量瓶，按“1.3.2” 节中显色法显色，在510 nm 处测定吸光度，根据标准曲线回归方程，求出相当于样品吸光度的芦丁浓度，按下式计算总黄酮含量：

式中C为样品中黄酮质量浓度(mg/mL)，V为黄酮溶液的体积50 mL，稀释倍数为40倍，m为样品质量(g)。

1.3.4 单因素试验 按表1设计的因素水平超声提取，分别考察单因素乙醇浓度、固液比、提取时间对密蒙花总黄酮含量的影响。

表1 单因素试验因素及水平

1.3.5 回归正交组合试验 根据单因素试验结果，对影响密蒙花总黄酮含量的三因素，乙醇浓度(x1)，固液比(x2)、提取时间(x3)进行二次回归正交组合试验。由于因素数m=3，二水平试验次数mc=8，星号试验次数mr=2m=6，零水平试验次数m0=3，根据星号臂长公式计算，得r=1.353。因素水平编码如表2 所示 。按“1.3.2”节法测定密蒙花总黄酮含量。

表2 回归正交组合因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 精密度试验 取芦丁对照品溶液，按“1.3.2” 节中显色法显色，在510 nm波长处连续测定6次，吸光度的RSD为0.22%，表明仪器精密度良好。

2.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按“1.3.2” 节中显色法显色，在510 nm波长处，按0、1、2、4、6、8 h不同时间间隔测定吸光度，计算吸光度的RSD为1.22%，表明供试样品在8 h内稳定性良好。

2.3 重复性试验 称取6份同样的样品约1.0 g，按样品溶液制备方法处理，“1.3.2” 节中显色法显色，在510 nm 处测定吸光度，计算RSD为1.04%，表明测定方法重复性好。

2.4 加样回收试验 称取6份已知含量的密蒙花药材粉末约0.5 g，分别加入芦丁对照品适量，按样品溶液制备方法处理，进行测定，计算加样回收率，结果见表3，平均回收率为101.46%，RSD为2.31%，表明该方法准确度较高。

表3 加样回收率测定结果

2.5 单因素试验

2.5.1 提取溶剂乙醇浓度的影响 随着乙醇浓度的升高，密蒙花中黄酮含量逐渐增加，当乙醇浓度为60%时，黄酮含量最高，继续增加乙醇浓度，含量反而下降。如图2所示。

2.5.2 固液比的影响 料液比为1∶40时，黄酮含量最高，但随着溶剂用量的增加，黄酮含量呈下降趋势，因此，不需要继续提高溶剂用量。如图3所示。

2.5.3 提取时间的影响 由图4可见，提取时间为30 min时，黄酮含量最高，当再延续提取时间，黄酮含量明显下降。如图4所示。

2.6 回归正交组合试验 按照表2安排的试验水平进行超声提取，按照三元二次回归正交组合设计的统计方法进行分析，得出密蒙花中总黄酮含量(Y)与各因素间的回归方程为：

(1)

回归方程(1)式中b0的计算式为：

(2)

第二次显著性测验结果(见表4))显示，方程(2)式F回=6.65>F0.01，二次回归方程在α=0.01时，达极显著水平，此方程可作为提取密蒙花中总黄酮数字模型的基本方程式。

表4 二次回归正交组合试验设计及结果

表5 总黄酮提取工艺正交试验回归关系方差分析

表6 总黄酮提取工艺正交试验回归关系第二次方差分析

2.7 模型寻优 对剔除不显著项变量后的回归方程(2)式求一阶偏导数，解方程组得x1=-0.453 5,x3=-0.221 2。将x1和x3代入原编码水平，得出各因素的最优试验水平为x1=53.30≈54,x3=32.5≈33。由试验数据统计计算结果可知，因素x1(乙醇浓度)和因素x3(固液比)对提取物中总黄酮含量有影响，而x2(提取时间)的影响不显著，综合考虑，取x2=r=1.353，代入原编码水平计算得。即最佳的提取工艺条件是用33倍量54%的乙醇超声提取密蒙花40 min。

2.8 验证试验 按上述最佳提取工艺进行试验验证(n=3)，提取物中总黄酮含量平均值为70.13 mg/g，表明所确定的最佳提取工艺合理可行。

3 结论

回归正交试验设计是把正交试验设计、回归数据处理和回归精度统一起来的回归设计与分析方法，兼备了正交设计与回归分析两者的优点。不仅可以找到与试验点较为贴近的数学模型，而且减少了试验次数，数据分析上的计算也很简洁，对实际应用有很好的指导意义。利用超声法提取密蒙花总黄酮具有提取率高，缩短提取时间，并且避免高温对黄酮类成分的破坏。本试验以提取物中总黄酮含量为评价指标，采用二次回归正交组合设计，确定密蒙花中总黄酮含量的最佳提取工艺条件为乙醇浓度54%，固液比1∶33(g：mL)，提取时间40 min，在此条件下提取的黄酮含量达70.13 mg/g。并拟合出了密蒙花总黄酮提取与各因素变量的回归方程数字模型，模型拟合较好，达极显著水平，有一定的应用价值。