siRNA介导靶向下调TRPV1对偏头痛大鼠的影响及可能机制研究

刘美霞，刘群会，周龙

(恩施土家族苗族自治州中心医院，1.神经内科；2.神经外科，湖北 恩施 445000)

有数据显示，偏头痛是神经内科最常见疾病，其患病率在全球成年人群中占11%，在我国约9.3%；且近年呈明显上升，尤以女性多见[1-2]。偏头痛多表现为慢性疾病，迁延不愈，给患者生活和工作造成极大困恼，是临床工作者及学者研究的重点；但至今其发病机制仍不十分清楚。目前，通常认为其是神经源性炎症，与中枢敏化、痛觉处理过程异常和皮质兴奋性增高等相关[3-4]。瞬时感受器电位香草酸受体(transient receptor potential vanilloid,TRPV1) 是瞬时受体电位 (transient receptor potential,TRP ) 超家族-V亚家族的一种非选择性阳离子通道，多表达于神经细胞膜上，在炎性疼痛发生发展中地位显著[5]。硝酸甘油是一氧化氮供体，后者可通过介导降钙素基因相关肽(calcitoningene related peptide,CGRP)等多种神经肽释放触发神经源性炎症，最终导致偏头痛发作，具有成本低、方便，且可在清醒状态观察模型动物行为变化等优势，在偏头痛建模中应用较广[6]。本研究采用此法建立偏头痛大鼠模型，并通过siRNA靶向沉默TRPV1，探讨其对偏头痛大鼠的影响，并讨论其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

24只成年雌性SD大鼠购自湖北省医学实验动物中心；硝酸甘油溶液(规格：1 mL，生产批号：20180522)购自上海榕柏生物技术有限公司；siRNA-TRPV1重组质粒和siRNA空载质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司设计及构建；总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Sigma公司；Applied BiosystemTMSYBRTM实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；BK、PGE、CCL2和5-HT ELISA试剂盒均购自上海科顺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立偏头痛大鼠模型 24只成年雌性SD大鼠，质量约200 g，温度、湿度适宜，昼夜规律，自由饮食，所有饲养及流程均符合《动物伦理审查基本原则》规定。本研究参照Tassorelli Cristina法[7]建立偏头痛模型：于大鼠背部注射硝酸甘油溶液2 mL(10 mg/kg)，每周1次，共5周。判断方法及标准：于每天注射硝酸甘油溶液后30 min左右，大鼠开始出现双耳发红、爬笼和挠头次数增加等烦躁不安的症状，可持续3 h左右，后开始蜷卧，活动减少，认为造模成功。

1.2.2 构建重组质粒及分组 参考GeneBank中SD大鼠TRPV1基因序列设计相关靶序列，并在正义链和反义链5’端分别引入Kpn I和Bgl II酶切位点，95 ℃退火，与双酶切骨架质粒相连，转化，然后抽提、纯化、冻融及收集病毒上清液，构建siRNA-TRPV1重组慢病毒，以备后续研究。按照此方法建立siRNA空载重组慢病毒。本研究共分为3组：siRNA-TRPV1组(siRNA-TRPV1重组慢病毒感染大鼠)、siRNA空载组(siRNA空载重组慢病毒感染大鼠)和空白对照组(无任何处理方式)，每组8只。其中感染方式为一次性将100 μL病毒液注入大鼠腹腔，继续正常饲养，方式同前。

1.2.3 采用实时荧光定量PCR法检测各组血液TRPV1mRNA表达 转染后第1 d，参照总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒操作说明书完成总RNA提取及cDNA制备；后参考Applied BiosystemTMSYBRTM实时荧光定量PCR试剂盒操作说明书进行PCR扩增及荧光定量检测，反应条件为：95 ℃ 1 min， 92 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。其中以β-actin为参比基因，以2-△△Ct表示TRPV1mRNA相对表达水平，△Ct=TRPV1-Ct—β-actin-Ct。

1.2.4 行为观察 转染后第1 d设定一个时间，从该时间点开始记录每组大鼠第一次耳红开始及结束时间，以30 min为时间间隔，设定6个时间段(0～30、31～60、61～90、91～120、121～150和151～180 min)，并记录各时间点挠头和爬笼次数。

1.2.5 采用ELISA法检测各组血液BK、PGE、CCL2和5-HT表达 分别于第1 h、2 h和第3 h 抽取腹主动脉血1 mL置于抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液-血浆进行BK、PG、CCL2和5-HT检测，具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组血液TRPV1mRNA比较

转染后，siRNA-TRPV1组、siRNA空载组和空白对照组三组大鼠血液TRPV1mRNA相对水平比较差异具有统计学意义(P<0.001)，siRNA-TRPV1组明显低于siRNA空载组和空白对照组(P<0.001)，但siRNA空载组和空白对照组两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 各组行为指标比较

siRNA-TRPV1组、siRNA空载组和空白对照组三组大鼠耳红开始时间、结束时间及各时间段爬笼及挠头次数比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，且表现为：siRNA空载组和空白对照组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-TRPV1组开始时间晚于以上两组，而结束时间则早于前两组(P<0.05)；siRNA-TRPV1组各时间段爬笼及挠头次数明显少于siRNA空载组和空白对照组(P<0.05)；见表1和表2。

表1 各组耳红变化时间比较

表2 各组爬笼及挠头次数比较

*注：三组比较均有aP、bP、cP、dP、eP及fP<0.05。

2.3 各组炎症因子比较

siRNA-TRPV1组、siRNA空载组和空白对照组三组大鼠血液BK、PGE、CCL2和5-HT比较差异具有统计学意义(P<0.05)，siRNA-TRPV1组明显低于siRNA空载组和空白对照组(P<0.001)，但siRNA空载组和空白对照组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组炎症因子比较

2.4 各炎症因子与TRPV1mRNA的关系

经Pearson法分析得知，TRPV1与BK、PGE、CCL2和5-HT呈正相关(r=0.631/0.694/0.654/0.663,P=0.001/0.001/0.001/0.001)。见图2。

3 讨论

偏头痛发病机制复杂，难以从根本上阐明，目前关于其理论主要基于假说，主要包括皮质扩展抑制学说和脑干-三叉神经-血管反射学说；近年随着基因研究不断普及，学者们试图从基因水平解释偏头痛[8-9]。TRPV1基因最初发现于外周初级感觉神经元中，近年发现其也在中枢神经系统中表达，在大脑对炎症疼痛转化及调节中占重要地位[10]。当机体发生炎症，可表现为红肿热痛，机体可释放缓激肽、前列腺素、趋化因子及P物质等炎症相关因子[11]。有学者研究发现炎症反应可使TRPV1mRNA及蛋白水平明显升高，而炎症得到控制后其随之降低[12]。

偏头痛可被认为是一种中枢性炎症疾病，有研究表明TRPV1在偏头痛患者中呈高表达，但未进行相关机制研究[13]。本研究利用重组慢病毒，具有敲除基本准确、效率高、可稳定表达等优点，通过siRNA介导达到靶向敲除TRPV1基因目的，本研究主要分为三组：siRNA-TRPV1组、siRNA空载组和空白对照组，第一组和第三组是为了探讨TRPV1作用价值，而siRNA空载组设定是为了排除质粒本身对实验的影响。在本研究中siRNA空载组和空白对照组所有研究结果比较差异无统计学意义(P>0.05)，证实空载质粒对本研究影响可不予重视。本研究siRNA-TRPV1组TRPV1mRNA明显降低，从微观上提示敲除模型建立成功；与其余两组比较，siRNA-TRPV1组耳红开始时间晚，结束时间早，且爬笼、挠头次数减少，从宏观上说明敲除模型建立成功，且提示TRPV1对偏头痛的重要性。本研究还发现siRNA-TRPV1组TRPV1mRNA和炎症相关因子(BK、PGE、CCL2和5-HT)均明显下降，提示TRPV1和炎症相关因子在偏头痛中占有重要地位；后经Pearson法分析得知TRPV1与炎症相关因子均呈明显正相关(P<0.05)，提示TRPV1可能通过激活巨噬细胞系统，释放BK、PGE、CCL2和5-HT，参与偏头痛发生发展，为其机制研究提供了更多理论依据。

综上认为，靶向下调TRPV1可明显减少硝酸甘油致偏头痛大鼠爬笼、挠头等症状发生次数，与BK、PGE、CCL2和5-HT等相关炎症因子水平降低相关，为偏头痛患者的有效治疗提供了新思路。