茶树油提取物粉对小鼠免疫功能的影响

庞艳华，郝福星，韩玲玲，韦芊含，赵泽婷，陈昕,张雨梅,3*

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300；3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009)

茶树为桃金娘科白千层属植物，茶树油是从其新鲜枝叶中提取的，经水蒸气蒸馏得到的天然芳香精油[1-2]。茶树油主要由单萜组成，具有抗细菌[3]，抗真菌[4]，抗病毒[5]和消炎等作用。在澳大利亚，茶树油作为民间药物常用来治疗感染、炎症、腹泻和外伤[6]。在二战期间，茶树油也发挥了巨大作用，在治疗伤员的皮肤损伤上效果显著[7]。目前茶树油是已发现的天然物质中抗菌作用最强的，也是极具价值和发展潜力的纯天然植物精油之一[8-9]。

目前，我国对茶树油无论是提取还是深加工都得到了很好的成果，，茶树油及其相关产品的开发应用具有良好的前景。本研究拟通过灌胃给予小鼠茶树油，首先进行急性毒性试验，确定LD50值，然后通过小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性试验、脾淋巴细胞增殖能力试验、免疫器官指数试验、测定血清溶血素水平及外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群水平，考察茶树油提取物粉对小鼠免疫功能的影响，为探索茶树油及其主要成分的作用，获得可靠数据，以研制出新的茶树油深加工产品，为茶树油产品在日化、食品、香料、医药等行业的应用提供理论基础[10-11]。

1 材 料

1.1 实验动物 ICR小鼠(清洁级)，体重18～22 g，购自扬州大学比较医学中心。动物生产许可证号为SCXK(苏)2017-0004，使用许可证号为SYXK(苏)2017-0044。饲喂经60Co照射饲料，环境温度为(24±2)℃，湿度为(60±20)%，饮水为符合城市饮用水标准的自来水。试验开始前于实验环境中适应3 d，灌胃前禁食12 h，不限制其饮水。

1.2 试验药品 茶树油提取物粉(澳叶宝)，由20%澳洲茶树油提取物与微晶纤维素制成的白色粉末，由江苏无锡晨芳生物科技有限公司提供，批号为20160320。

表1 茶树油提取物主要成分Tab 1 The main composition of the tea tree oil extract powder/%

1.3 主要试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国HyClone公司；100×青霉素链霉素溶液，购自碧云天生物技术有限公司；MTT、小鼠淋巴细胞分离液、台盼蓝均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，MTT用pH7.2～7.4 PBS配成5 mg/mL的溶液，微孔滤器过滤除菌，4℃避光保存，不能超过1个月，现配现用；刀豆蛋白A Ⅳ(ConA，Ⅳ)，购自美国Sigma公司，20 μg/mL ConA 用RPMI1640完全培养液稀释，微孔滤器过滤除菌，现配现用；DMSO，购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方 法

2.1 急性毒性试验 根据预试验结果，茶树油提取物粉剂量达5000 mg/kg b.w.时，小鼠未出现死亡。因茶树油提取物粉的毒性较小，无法测出LD50数值，根据急性毒性试验技术规范，对茶树油提取物粉进行最大给药量试验。

取ICR小鼠20只，雌、雄各半，以0.2 mL/10g b.w.给药容积灌胃，剂量为5000 mg/kg b.w.。连续观察2周，并记录动物中毒症状及死亡情况。

2.2 对小鼠免疫功能的影响

2.2.1 试验分组 将ICR小鼠随机分成4组，每组10只，雌雄各半。茶树油提取物粉以1%羧甲基纤维素钠溶液配制成混悬液，灌胃给予。茶树油提取物粉试验组分为高剂量(1250 mg/kg b.w.)、中剂量(250 mg/kg b.w.)、低剂量组(50 mg/kg b.w.)以及1%羧甲基纤维素钠对照组。以0.2 mL/10g b.w给药容积灌胃，每天给药一次，连续灌胃10 d后，分别进行以下试验。

2.2.2 免疫器官指数试验 ICR小鼠分组及处理同2.2.1。小鼠连续灌胃10天后，于第11天，脱颈椎处死小鼠，称量小鼠体重及肝脏、脾脏、胸腺的重量，并按以下公式计算免疫器官指数(肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数)[12]。

免疫器官指数=免疫器官鲜重(g)/体重(g)×100%

2.2.3 腹腔巨噬细胞吞噬活性试验 小鼠灌胃10 d后，于第11天，按照文献[13]的方法，测定腹腔巨噬细胞吞噬活性。

2.2.4 脾淋巴细胞增殖试验 小鼠灌胃10 d后，于第11天，无菌取脾、研磨后过200目不锈钢网，用RPMI 1640完全培养液制成单细胞悬液。根据文献[14]的方法，测定脾淋巴细胞增殖能力。

2.2.5 外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群水平测定试验 小鼠连续灌胃10 d，于末次灌胃12 h后，摘眼球采血0.5 mL，以4% EDTA-Na2抗凝。根据文献[15]的方法，测定小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞水平。

2.2.6 血清溶血素水平测定试验 小鼠分组及处理同2.2.1。于灌胃第3天 ，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的5%鸡红细胞进行免疫，小鼠免疫后再连续灌胃7 d，摘眼球取血，根据文献[16]的试验方法，测定血清溶血素。

2.3 数据处理 数据统计采用SPSS17.0软件，以平均数±标准差表示。采用单因素分析Duncan's法进行显著性分析，以P<0.05作为差异显著性水平。

3 结果与分析

3.1 茶树油提取物粉的小鼠急性毒性试验 茶树油提取物粉按5000 mg/kg b.w.剂量灌胃给予小鼠后，二周内未见明显的眼观异常。

茶树油提取物粉对小鼠经口LD50大于5000 mg/kg b.w.，根据WHO对化学物急性毒性分级标准，茶树油提取物粉属于实际无毒级别。

3.2 茶树油提取物粉对小鼠免疫器官的影响 不同剂量茶树油提取物粉对小鼠免疫器官指数的影响见表3-1。与对照组相比，茶树油高、中、低剂量组均能极显著增加小鼠脾脏指数(P<0.01)； 250 mg/kg b.w.剂量组能显著提高小鼠肝脏指数和胸腺指数(P<0.05)；50、1250 mg/kg b.w.剂量组的肝脏指数和胸腺指数的差异不显著(P>0.05)。

表3-1 对小鼠免疫器官指数的影响Tab 3-1 Effect on immune organ index in mice/%

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Compared with the normal control group, *P<0.05, **P<0.01

3.3 腹腔巨噬细胞吞噬活性试验 不同剂量的茶树油提取物粉对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响见表3-2。由表3-2可以看出，与对照组相比，茶树油提取物粉三个试验剂量，都可增加小鼠巨噬细胞的吞噬活性，但50 mg/kg b.w.剂量差异不显著(P>0.05)；250 mg/kg b.w.剂量组差异极显著(P<0.01)；1250 mg/kg b.w. 剂量组差异显著(P<0.05)。

表3-2 对小鼠巨噬细胞吞噬活性、血清溶血素及脾淋巴细胞增殖的影响Tab 3-2 Effects of phagocytic activity, serum hemolysin and spleen lymphocyte proliferation in mouse macrophages

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.4 茶树油提取物粉对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

不同剂量组茶树油提取物粉对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响结果见表3-2。由表可以看出，与对照组相比，茶树油提取物粉三个试验剂量处理后，小鼠脾淋巴细胞刺激指数均显著升高(P<0.05)。50 mg/kg b.w.剂量组刺激指数显著提高；250 mg/kg b.w.剂量组和1250 mg/kg b.w.剂量组刺激指数极显著的升高，极显著的增强了小鼠脾淋巴细胞增殖能力。

3.5 茶树油提取物粉对外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群水平的影响 茶树油提取物粉对小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群水平的影响结果见表3-3。与对照组相比，50 mg/kg b.w.剂量组CD3+CD8+T淋巴细胞数量显著增加(P<0.05)；250 mg/kg b.w.剂量组CD4+/CD8+比值显著增加(P<0.05)；高、中低剂量茶树油提取物对小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+CD8+指标无显著影响(P>0.05)。

表3-3 对小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群的影响Tab 3-3 Effects of CD3+, CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets in peripheral blood of mice

与正常对照组比较，*P<0.05

Compared with the normal control group,*P<0.05

3.6 茶树油提取物粉对小鼠血清溶血素水平的影响

茶树油提取物粉对小鼠血清溶血素的影响结果见表3-2。由表可以看出，与对照组相比，250 mg/kg b.w.和1250 mg/kg b.w. 剂量组中小鼠血清溶血素水平均显著性增加(P<0.05)。但50 mg/kg b.w.剂量组中小鼠血清溶血素水平增加不显著(P>0.05)。

4 讨论与结论

4.1 小鼠急性毒性实验 急性毒性实验一般采用啮齿类或非啮齿类两种动物。通常为小鼠或大鼠采用经口、吸入或经皮感染途径。对小鼠进行一次或24 h内多次接触外源化学物后，观察动物急性中毒表现，来了解新药急性毒性的强弱，为长期毒性试验和特殊毒性试验剂量设置提供依据，同时为新药药学研究提供参考[17]。本试验中茶树油提取物粉经口LD50大于5000 mg/kg b.w.，属于实际无毒级别。

4.2 小鼠免疫器官与免疫功能 免疫器官是机体免疫系统的重要组成部分，胸腺是T淋巴细胞分化成熟的部位，脾脏是机体内最大的外周免疫器官，介导着全身的体液免疫和细胞免疫[18]。而肝脏又是体内最大的解毒器官，机体主要靠肝脏来代谢，承担着维持生命的重要功能。免疫器官指数是衡量机体免疫器官发育情况的经典指标。本次试验中，不同剂量的茶树油提取物粉能显著提高小鼠的脾脏指数，对小鼠的脾脏发育有着极明显的促进作用，而250 mg/kg b.w.剂量组的肝脏指数和胸腺指数有显著提高，效果最好。这说明茶树油提取物粉能促进脾脏、肝脏和胸腺等免疫器官的增重，增强了机体的免疫功能。

4.3 腹腔巨噬细胞是评价免疫功能的重要指标 巨噬细胞广泛分布于机体内，在免疫反应中具有重要作用，它不仅参与非特异性吞噬功能，还是特异性免疫中一类关键的细胞[19-20]。巨噬细胞能参与摄取、加工、处理、提呈抗原并激发免疫反应。本次实验中，通过对小鼠腹腔巨噬细胞的收集、分离和培养，探讨茶树油提取物粉对小鼠免疫功能的影响。实验结果表明，茶树油提取物粉三个试验剂量，都可增加小鼠巨噬细胞的吞噬活性，这说明茶树油提取物粉能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，促进小鼠巨噬细胞的吞噬作用。

4.4 小鼠脾淋巴细胞增殖是评价免疫功能的重要指标 小鼠淋巴细胞的转化功能可以作为特异性细胞免疫功能的指标，是评价机体免疫功能的重要指标之一，淋巴细胞的增殖状况反映了机体细胞免疫的状况。脾细胞的增殖能力可以通过研究脾脏T淋巴细胞在促分裂剂ConA作用下的增殖能力来反应细胞免疫功能[24]。刺激指数SI值与活脾脏淋巴细胞数呈正相关。SI值越大，淋巴细胞增殖能力越强。试验不同剂量组茶树油提取物粉对小鼠脾淋巴细胞的增殖转化影响。试验结果表明，茶树油提取物粉三个剂量组的SI值显著高于正常对照组，这说明不同剂量组的茶树油提取物粉能促进淋巴细胞的增殖转化，且250 mg/kg b.w.和1250 mg/kg b.w.剂量组效果显著。证实茶树油提取物粉在一定剂量下能提高特异性细胞免疫功能，增强细胞免疫。

4.5 外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群是评价免疫功能的重要指标 淋巴细胞亚群主管细胞免疫，具有抵抗病毒和调节免疫系统功能的作用[25]，细胞功能取决于T淋巴细胞总值(CD3+)及其亚群(CD4+、CD8+)的相对组成。流式细胞分析仪FCM根据淋巴细胞表面标志的不同来检测各淋巴细胞亚群。用CD4+/CD8+比值来判断机体内部是否紊乱，CD4+/CD8+比值上升，则表明细胞免疫功能活跃，反之则细胞免疫功能处于迟滞状态[26]。试验结果发现，茶树油提取物粉250 mg/kg b.w.剂量组CD4+/CD8+比值显著增加(P<0.05)，表明细胞免疫功能处于活跃状态，其他剂量组与对照组相比差异不显著。这说明250mg/kg b.w.剂量的茶树油提取物粉对细胞免疫功能有促进作用，能提高机体的免疫功能。

4.6 血清溶血素是评价免疫功能的重要指标 小鼠血清溶血素的水平是一项机体非特异性免疫功能的主要指标[20-21]，溶血值的测定反映了B细胞的增殖分化以及与补体结合后向体液中分泌溶血素的能力，其介导的是体液免疫[22]。通过测定溶血素值，用以检测药物对机体防御能力的影响[23]。本实验中，茶树油提取物粉三个试验剂量组中，小鼠血清溶血素水平都有所增加，这说明茶树油提取物粉具有刺激B细胞分化增殖转变为浆细胞的功能，促进小鼠溶血素抗体的生成，提高抗体水平，增强小鼠体液免疫功能。

4.7 结论 茶树油提取物粉经口LD50大于5000 mg/kg b.w.，根据WHO对化学物急性毒性分级标准，茶树油提取物粉属于实际无毒级别。

不同剂量的茶树油提取物粉对小鼠的脾脏指数都有着极明显的促进作用，对肝指数和胸腺指数也有一定的促进作用。

茶树油提取物粉通过促进小鼠巨噬细胞的吞噬活性、淋巴细胞的增殖、提高血清溶血素的水平以及CD4+/CD8+比值，表明茶树油提取物粉对小鼠免疫功能具有促进作用。

茶树油提取物粉通过增加免疫器官指数、增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性、脾淋巴细胞的增殖能力、提高血清溶血素的水平以及CD4+/CD8+比值，表明茶树油提取物粉对小鼠免疫功能具有一定的促进作用。