转氨酶正常或轻度增高的慢性乙型肝炎患者肝穿刺活检病理特征

周保仓

慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒(HBV)检测为阳性，病程超过半年而伴有慢性肝炎典型临床表现[1]。临床上反映肝功能的转氨酶实验室检查指标包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、ALT/AST比值、γ-谷氨酰转肽酶等13项。研究发现转氨酶在反映肝细胞功能方面并不具有直接的指向性意义，二者间的关系受到较多混杂因素的干扰，而病理活检由于其准确性和特异度较好，往往是诊断各项疾病采用的金标准[2]。本研究拟选取转氨酶正常或轻度增高的慢性乙型肝炎患者，对其进行肝穿刺活检病理特征分析。

资料和方法

一、研究对象

选取2013年2月至2017年1月我院传染科收治的慢性乙型肝炎患者。慢性乙型肝炎的判定标准为：(1)HBV检测为阳性；(2)病程超过半年；(3)典型临床表现：大部分患者可有乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状。转氨酶正常或轻度增高的判定标准为：ALT水平0～65 U/L或AST水平0～60 U/L。符合以下情况当中任意一种的患者需剔除：(1)合并甲型、丙型、丁型、戊型等其他肝炎病毒重叠感染者；(2)自身免疫性肝病患者；(3)酒精性或药物依赖性肝病患者。

二、方法

活检穿刺设备型号为Bard51BS0672型。

经所有受试者同意行肝穿刺活检。术前密切监测患者B超肝穿刺定位、凝血酶原时间、各项血常规值等。穿刺活检获得肝组织后均经福尔马林固定、石蜡包埋、苏木-伊红染色进行制片；肝组织炎性坏死及纤维化程度的分期参考《病毒性肝炎防治指南(2015年版)》。同时提取患者肝组织HBV DNA。(1)去除石蜡：将石蜡包埋组织切成5～10 μm后，用灭菌小镊子(使用前用UV照射10 min以上)将3张切片放入1.5 mL Eppendorf管中，将1 mL二甲苯(去除石蜡)加入Eppendorf管中，盖好盖子，漩涡振荡10 s，4 000 r/min室温离心2 min，去上清，然后添加1 mL无水乙醇(去除二甲苯)，漩涡振荡混匀，14 000 r/min，室温离心2 min，弃上清，打开盖子，在室温最高至37 ℃时孵育10 min，直至无乙醇残留。(2)裂解：加入180 μL BufferGTL，使以上沉淀重悬，加入20 μL ProteinaseK，漩涡振荡混匀，56 ℃消化过夜，使组织彻底消化，在一定程度上可提高DNA产量。样本通过蛋白酶K消化，在变形条件下裂解。(3)加热：在70 ℃下孵育1 h，逆转福尔马林交联。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底，将以上溶液注入到吸附柱上，盖好管盖，8 000 r/min离心1 min，弃上清。(4)结合：小心打开管盖，向吸附柱中加入550 μL Buffer GW2(使用前添加无水乙醇)，盖好管盖，8 000 r/min，离心1 min弃上清，再14 000 r/min离心3 min，将DNA结合到硅胶膜上，杂质不结合。(5)洗涤：将75 μL Buffer GE溶液加入吸附柱膜中，室温放置5 min，14 000 r/min离心1 min，再重复以上步骤1次，将残留的污染物洗掉，收集DNA溶液。(6)提取：所得液体即为DNA样品，分装于干净消毒的1.5 mL Eppendorf，-20 ℃冻存保存。HBV DNA的提取等工作由北京贝瑞和康生物技术有限公司完成。

三、统计学处理

采用率、构成比、相对比、均数、中位数、标准差对结果进行统计学描述。计量资料服从正态分布，采用两独立样本t检验或F检验进行比较；不服从正态分布，采用两独立或多组样本秩和检验进行比较。采用χ2检验、Fisher确切概率法及Spearman等级相关对病理学分级、分期与HBV DNA水平等资料的关联性进行分析。无特殊说明情况下显著性水平α=0.05，所有P值表示双侧概率。

结 果

一、受试者一般资料

本研究共收集到慢性乙型肝炎患者152例，患者平均年龄(35.90±7.55)岁，其中男性86例(56.58%)，HBsAg(+)患者96例(63.16%)，HBeAg(+)患者26例(17.11%)，抗Hbc(+)患者18例(11.84%)，初中及以下文化水平的患者57例(37.50%)，有家族史的患者25例(16.45%)，有高危性生活史的患者41例(26.97%)，有输血史的患者22例(14.47%)，有创伤性美容史的患者35例(23.03%)，有手术史的患者76例(50.00%)。

二、慢性乙型肝炎患者炎症分期影响因素的单因素分析

采用χ2检验、Fisher确切概率法对不同分类群体中慢性乙型肝炎患者炎症各分期人数构成比进行比较。结果显示，性别、年龄、是否HBsAg阳性、是否HBeAg阳性、是否抗HBc阳性、家族史、创伤性美容史、手术史、输血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者炎症分期的影响因素(均P<0.05)。结果见表1。

表1 慢性乙型肝炎患者炎症分期影响因素的单因素分析(n=152)

注：*表示差异有统计学意义(P<0.05)

三、慢性乙型肝炎患者纤维化分期影响因素的单因素分析

对不同分类群体中慢性乙型肝炎患者纤维化各分期人数构成比进行比较，结果显示，性别、年龄、是否HBsAg阳性、是否HBeAg阳性、家族史、创伤性美容史、手术史、输血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者纤维化分期的影响因素(均P<0.05)。结果见表2。

四、慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量影响因素的单因素分析

既往研究报道，由于DNA定量测定结果本身不具有较好的正态分布性，但可经对数转换使其近似服从正态分布(P>0.05)，故此处先对原始定量结果取对数后进行单因素分析。若经转换后仍不服从正态分布则采用两独立或多组样本秩和检验进行单因素分析。结果显示，年龄、是否HBsAg阳性、是否HBeAg阳性、家族史、创伤性美容史、手术史、输血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量的影响因素(均P<0.05)。结果见表3。

表2 慢性乙型肝炎患者纤维化分期影响因素的单因素分析(n=152)

注：*表示差异有统计学意义(P<0.05)

五、慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量水平与其病理特征的相关性

采用Spearman等级相关对病理学分级、分期与HBV DNA水平等级(取所有HBV DNA定量水平对数后，以其中位数作为阈值将HBV DNA水平分为高低两水平)资料的关联性进行分析。结果显示，HBV DNA水平等级与炎症等级呈正相关且相关系数差异有统计学意义(rs=0.314，P<0.05)，而与纤维化等级的相关系数差异无统计学意义(rs=0.178，P>0.05)。

表3 慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量影响因素的单因素分析(n=152)

注：*表示差异有统计学意义(P<0.05)

讨 论

有研究表明，慢性乙型肝炎患者肝脏病理炎症分级、外周微循环变化以及纤维化程度分期密切相关，而目前肝穿刺组织活检仍然是判定慢性肝炎炎症、纤维化程度的金标准[3]。ALT主要存在于肝细胞浆内，1%的肝细胞发生损伤后就能使血清ALT浓度增高1倍；因此，ALT可以作为肝功能损害的评价指标之一，其轻度升高可以作为疾病进展的重要标志[4]。研究表明，ALT越高，肝炎疾病及纤维化的进展发生率就越高，但是如果免疫反应仅引起炎症和纤维化，未损伤肝细胞，肝细胞浆内的酶未释放入血，血清转氨酶可不升高[5]。

本研究年龄、是否HBsAg阳性等一系列因素均与炎症及纤维化病变存在关联。其原因可能是乙型肝炎患者可以通过不同的途径感染乙肝引起病理学变化，且创伤性美容史、手术史、输血史等均能够直接诱发外源性感染，最终造成肝脏炎症甚至纤维化的发生[6]。病理学分级、分期与HBV DNA水平等级进行相关性分析时也发现，HBV DNA水平等级与炎症等级呈正相关。其原因可能是机体感染的时间延长，病毒在体内的拷贝数呈现指数级增长，继而导致免疫复合物急性沉着在肝组织导致栓塞形成，引起急性肝坏死而导致死亡，从而诱发炎症病理反应[7]。本研究还发现，HBV DNA水平等级与纤维化等级不具有相关性。其可能是因为机体代偿能力不足以应付病变速度的结果，通常只有在疾病进展到不可逆的阶段才发生。转氨酶正常或轻度增高的慢性乙型肝炎患者及时并且全程接受抗病毒治疗，HBV DNA水平还是可以及时得到控制，病情逆转的概率很大，因此二者的相关性可能不是很明显[8]。