miR-375、miR-146a在原发性肝癌患者预后评估中的价值

李俊 郭旭利 黄维甄

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)为肝脏常见恶性实体瘤之一，其发病率位居癌症第二位[1-2]。目前针对PLC的预后评估缺少敏感度、特异性均较高的生物标志物。而研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可调控肿瘤细胞增殖、分化及侵袭，并参与肿瘤发生、发展等过程[3]。目前国内鲜有应用miR-375和miR-146a评估PLC预后的研究。因此本研究通过检测PLC患者血清中miR-375和miR-146a的表达情况，分析其在PLC预后评估中的价值及意义，为临床提供参考。

资料和方法

一、 一般资料

选择2015年9月至2017年3月我院收治的65例PLC患者(PLC组)、49例乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化组)、51例乙型肝炎患者(肝炎组)及47名同期健康体检者(健康对照组)作为研究对象。65例PLC患者均经穿刺活检病理确认，男性32例、女性33例，年龄(53.2±6.7)岁，肝功能Child-Pugh分级A级57例、B级8例。肝硬化组男性23例、女性26例，年龄(51.5±7.0)岁。肝炎组男性22例、女性29例，年龄(52.2±7.4)岁。健康对照组男性27例、女性20例，年龄(54.6±6.9)岁。四组受试者在性别(c2=2.128，P=0.546)、年龄(F=1.792，P=0.150)方面具有可比性。纳入标准：①均接受肝动脉栓塞化疗术(TACE)；②检测血清miR-375、miR-146a前未使用过化疗药物、靶向药物或接受过放疗；③无治疗禁忌证。排除标准：①药物或酒精性肝损伤者；②活动性肝炎患者。本研究受试者均签署知情同意书，且本研究经我院医学伦理委员会批准。

二、方法

(一)血清miR-375、miR-146a表达量检测

采用实时荧光定量PCR法检测PLC患者血清miR-375、miR-146a相对表达量。具体步骤如下：①抽取四组受试者空腹静脉血，离心，提取上层血清；②用总RNA提取试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]提取血清中总RNA，A260/A280在1.8～2.0之间；③用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒(美国Applied Biosystems公司) 合成cDNA，95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循环40 次。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct表示miR-375、miR-146a的相对表达量。

(二) 肝动脉栓塞化疗术

首先股动脉穿刺，将导管插至肝固有动脉和其分支处。进行造影，观察并确定肿瘤供血动脉。确定肿瘤供血动脉后将导管插入肿瘤供血动脉，在X线下将化疗药物吡喃阿霉素(浙江海正药业股份有限公司，H33021980)10～30 mg和顺铂(齐鲁制药有限公司，H37021358)20 mg注入肿瘤供血动脉，栓塞。术后，再次进行造影，检查栓塞程度。根据患者治疗情况确定TACE治疗次数、时间间隔。

(三)随访

采用电话随访对65例PLC患者进行1年的跟踪随访，了解患者生存情况。随访期间，无1例失联。

三、 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行处理及分析，服从正态分布的计量资料以均数±标准差表示，PLC组、肝硬化组、肝炎组和健康对照组四组间计量资料比较采用F检验，两两比较采用SNK检验；PLC患者治疗前后计量资料比较采用配对样本t检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价miR-375、miR-146a诊断PLC患者生存预后的效能。采用Kaplan-Meier和Cox多因素回归分析PLC患者生存的独立影响因素。当P<0.05时，差异有统计学意义。

结 果

一、 miR-375、miR-146a在四组受试者血清中的表达量比较

PLC组、肝硬化组、肝炎组和健康对照组血清中miR-375的表达量分别为(0.3±0.1)、(0.6±0.2)、(0.9±0.3)和(0.9±0.2)，四组比较，差异有统计学意义(F=111.247，P<0.001)。 其中，PLC组患者血清miR-375表达量低于肝硬化组、肝炎组和健康对照组，差异有统计学意义(q=10.179、21.136、22.165，P<0.01)；肝炎组患者血清miR-375表达量与健康对照组相当，差异无统计学意义(q=1.435，P>0.05)。miR-146a在PLC组、肝硬化组、肝炎组和健康对照组血清中的表达量分别为(4.2±0.8)、(2.7±0.5)、(1.2±0.4)和(1.0±0.2)，差异有统计学意义(F=412.194，P<0.001)。 PLC组患者血清miR-146a表达量高于肝硬化组、肝炎组和健康对照组，差异有统计学意义(q=19.945、41.012、42.442，P<0.01)；肝炎组患者血清miR-146a表达量与健康对照组相当，差异无统计学意义(q=2.248，P>0.05)。详见图1。

二、 PLC患者治疗前后血清miR-375、miR-146a表达量变化

PLC组患者经TACE后血清miR-375表达量为(0.5±0.2)，较治疗前升高，差异有统计学意义(t=7.658，P<0.001)；血清miR-146a表达量为(3.2±0.7)，较治疗前降低，差异有统计学意义(t=-6.832，P<0.001)。

三、 PLC患者1年期生存情况

65例PLC患者均接受TACE，其1年生存率为81.5%(53/65)。

四、 PLC患者1年内生存组患者与死亡组患者血清miR-375、miR-146a表达量

生存组患者血清miR-375、miR-146a表达量分别为(0.3±0.1)和(3.9±0.6)，死亡组患者血清miR-375、miR-146a表达量分别为(0.2±0.1)和(5.3±0.6)，均差异有统计学意义(t=-4.408、6.456，P<0.001)。

图1 miR-375、miR-146a在PLC、肝硬化、肝炎患者和健康对照组血清中的表达水平

五、 血清miR-375、miR-146a表达量诊断PLC 1年生存期的效能

miR-375诊断PLC 1年生存期的AUC小于miR-146a，但差异无统计学意义(Z=1.554，P=0.120)。miR-375、miR-146a联合检测的效能高于miR-375，差异有统计学意义(Z=2.684，P=0.007)；miR-375、miR-146a联合检测的AUC略大于miR-146a，但差异无统计学意义(Z=0.535，P=0.592)。详见图2和表1。

图2 miR-375、miR-146a诊断PLC 1年生存期的ROC曲线

六、 影响PLC患者1年生存期的因素

对可能影响PLC患者1年生存期的因素行单因素分析，结果显示，病灶大小、白蛋白水平、Child-Pugh分级、miR-375和miR-146a表达量与PLC患者1年生存期有关。将单因素分析差异有统计学意义的指标带入Cox多因素回归分析，结果表明，病灶大小、miR-375和miR-146a表达量是PLC患者1年生存期的独立影响因素。详见表2。

讨 论

有研究表明，联合检测PTEN和EpCAM水平有助于预测肝癌预后和复发，但该方法需要获取肝脏癌变细胞，操作繁琐且评估预后效能较差[4]。既往研究指出，微RNA检测对多种肿瘤疾病预后均具有较高的敏感度及准确性，但国内未见应用微RNA诊断PLC预后的报道。因此，本研究检测PLC血清中miR-375和miR-146a的表达，探究其对PLC患者预后的价值。

miR-375基因属于基因间型的miRNA，其位于2号染色体长臂2区3带，Cryba2基因和Ccdc108基因之间。有研究显示[5]，miR-375在PLC患者中的表达水平较癌旁组织低。本研究显示，PLC患者血清miR-375表达量低于肝硬化组、肝炎组和健康对照组，提示检测血清miR-375水平有助于鉴别PLC。miR-146a亦为miRNA家族一员，其位于第五号染色体LOC285628基因的第二个外显子区。有研究证实[6]，miR-146a在肝癌中表达异常升高。本研究显示，PLC患者血清miR-146a表达量高于肝硬化组、肝炎组和健康对照组，提示miR-146a在血清中的特异性表达，对PLC具有诊断价值，可能原因为miR-146a的高表达抑制FOXO1基因在肝脏癌变细胞的表达，从而促进肿瘤细胞的分裂分化。

表1 miR-375、miR-146a诊断PLC 1年生存期的效能

表2 PLC患者1年生存期的影响因素分析

本研究中死亡组患者miR-375水平低于生存组患者，miR-146a水平高于生存组患者，提示miR-375和miR-146a可能与PLC患者预后存在联系，可能原因为miR-375通过靶向抑制AEG-1诱导肝癌细胞G1期阻滞和细胞凋亡；miR-146a可以通过干扰c-Myc表达而促使肝脏癌变细胞的增殖分化。

有研究指出[7-8]，miR-375和miR-146a的异常表达对PLC患者的预后判断具有较高的敏感性和特异性，均可作为PLC的标志物。本研究显示，miR-375、miR-146a联合检测的效能均高于单行miR-375或miR-146a检测，提示仅行miR-375或miR-146a检测虽存在一定价值，但均低于二者联合检测的AUC，故联合检测miR-375、miR-146a表达更有助于PLC预后评估。此外，经生存分析得知，病灶大小、miR-375和miR-146a表达量与PLC患者生存预后密切相关，提示临床治疗应密切观察PLC患者血清miR-375和miR-146a表达量。

本研究存在以下不足：样本量偏少，结果可能存在一定的随机性和偶然性；单中心研究，抽样误差大。下一步将进行多中心研究、增加样本例数，进一步阐明miR-375和miR-146a在PLC患者预后评估中的价值。