苹果砧木G.11试管苗增殖与生根培养研究

郭静，柴慈江，通信作者，史燕山，骆建霞，江文

苹果砧木G.11试管苗增殖与生根培养研究

郭静1，柴慈江1，通信作者，史燕山1，骆建霞1，江文2

（1. 天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2. 天津樱桃谷农业科技发展有限公司，天津 301908）

将苹果砧木G.11试管苗茎段分别接种于含有不同浓度的6-BA或KT的MS培养基中，或接种于含有不同浓度6-BA的WPM培养基中进行增殖培养。然后再将茎段接种于土壤做支撑物的培养基中进行生根培养。结果表明，6-BA可以明显促进G.11试管苗茎段萌芽与增殖，KT则对此无效；与MS培养基相比，WPM培养基可以显著降低G.11试管苗的玻璃化率；在含有6-BA 0.5 mg/L的WPM培养基中G.11试管苗的繁殖系数可达到4.9，玻璃化率为0；在以黏壤土或砂壤土做培养基支撑物的培养基中G.11试管苗的生根率分别为75.9%和76.7%，且试管苗生有根毛。本结果将为建立苹果砧木G.11的离体快速繁殖技术体系提供依据。

苹果砧木G.11；试管苗；增殖；生根

矮化密植栽培是世界苹果栽培的主要模式，也是我国苹果栽培发展的主要趋势。采用矮化自根砧是国外苹果矮化密植的主要措施，而我国目前尚缺乏优良的矮化自根砧，苹果矮化密植多采用矮化中间砧或利用短枝型品种的方式进行。近些年，国内一些单位陆续从国外引进矮化自根砧进行试验示范，并初见成效[1]。G.11是天津樱桃谷农业科技发展有限公司近年从美国引入的一个苹果砧木，属于半矮化砧[2]。为满足试验与推广中对G.11苗木的需求，课题组开展了G.11的离体快速繁殖技术研究。

目前，国内关于苹果矮化砧木组培快繁技术的研究已有许多报道。郭早霞研究了苹果砧木M.26的脱毒技术并改进了试管苗生根方法[3]。张庆田[4]、赵亮明等[5]和余亮[6]对M.9的初代、继代培养、生根及移栽技术进行了研究；周莉对M.9、Mac9、B9、SH6、SH38、SH40等6种苹果矮化砧木离体快繁技术的各个环节进行了优化研究[7]。张欣研究了苹果砧木G.41叶片再生体系的建立并对试管苗的增殖、生根及移栽驯化进行了研究[8]。关于苹果砧木G.11的组织培养快速繁殖技术国内尚未见研究报道。

1 材料与方法

以在含有0.5 mg/L 6-BA的MS培养基中继代培养的苹果砧木G.11试管苗为试材。生根培养用土为两种土壤，一种为取自天津农学院东校区地被植物园的黏壤土，6月份取土后装入塑料花盆，放置在露天地表，经一个雨季的雨水淋洗后，风干，过1 mm筛备用。另一种土壤为取自蓟州区的砂壤土，风干后同样过1 mm筛备用。

1.1 不同细胞分裂素影响G.11试管苗增殖的试验

以MS培养基为基本培养基，培养基中分别添加KT和6-BA 2种细胞分裂素，浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，以不添加植物激素为对照。每种培养基中均加入7 g/L琼脂为固化剂，pH调整至5.9，分装至100 mL三角瓶中，每瓶约40 mL培养基，在121 ℃下灭菌20 min。然后在超净工作台中每瓶接种4根长度约1 cm的G.11试管苗茎段，每个处理接种3瓶共12个茎段。接种后在恒温培养室培养，培养条件为：温度23～28 ℃，光照1 500～3 000 lx，每天光照14 h。培养40 d后调查试管苗形成的茎尖数、最大茎长、繁殖系数、玻璃化率等指标。玻璃化率用卡平方法做独立性测验，其他指标均按照完全随机试验单向分组资料的方法作方差分析，并按照邓肯氏新复极差法作多重比较。

1.2 不同培养基影响G.11试管苗增殖的试验

分别采用MS和WPM两种培养基，两种培养基中均加入1.0 mg/L的6-BA，用7 g/L琼脂做固化剂，pH调整至5.9，分装至100 mL三角瓶中，每瓶约40 mL培养基，在121 ℃下灭菌20 min。然后接种G.11试管苗约1 cm长的茎段，接种茎段数量与培养条件同试验1.1。培养40 d后调查试管苗的增殖状况，调查的各项指标及统计分析方法均同试验1.1。

1.3 WPM培养基中6-BA浓度影响G.11试管苗增殖的试验

在WPM培养基中分别添加不同浓度的6-BA，设0、0.5、1.0、1.5 mg/L 4个处理，各种培养基均以7 g/L琼脂做固化剂，pH调整至5.9，分装至100 mL三角瓶中，每瓶约40 mL培养基，在121 ℃下灭菌20 min。每瓶接种4根长度约1 cm的G.11试管苗茎段，每个处理接种4瓶共16个茎段。接种后在恒温培养室培养，培养条件同试验1.1。培养40 d后调查试管苗的增殖状况，调查的各项指标及统计分析方法均同试验1.1。

1.4 G.11试管苗的土壤支撑生根培养试验

本项试验设3个处理：

黏壤土支撑培养：以方形PC瓶为培养瓶，将上述黏壤土与蛭石按照1∶2的体积比混和后加入培养瓶，每瓶加入100 mL。然后每瓶加入60 mL培养液，培养液中含有0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖的蒸馏水，pH 6.5。培养基配制完成后在121℃下灭菌20 min，然后在超净工作台中接种G.11试管苗茎段，每瓶接入8根长约1 cm的G.11试管苗茎段，共接种4瓶32个茎段。

砂壤土支撑培养：以方形PC瓶为培养瓶，将上述砂壤土与蛭石按照1∶2的体积比混和后加入培养瓶，每瓶加入100 mL。然后每瓶加入60 mL 培养液，培养液的成分和培养基灭菌方法以及G.11试管苗茎段的接种方法及数量同黏壤土支撑培养。

琼脂支撑培养（对照）：以1/2MS培养基为基本培养基，培养基中添加0.5 mg/L的IBA和15 g/L的蔗糖，以7 g/L琼脂做固化剂，pH为5.9，以100 mL三角瓶为培养容器，每瓶装入培养基约40 mL，培养基配制完成后在121 ℃下灭菌20 min，然后在超净工作台中接种G.11试管苗茎段，每瓶接入4根长约1 cm的G.11试管苗茎段，共接种8瓶32个茎段。

上述各处理接种后在恒温培养室培养，培养条件同试验1.1。培养40 d后调查试管苗的生根率、根长、茎长、叶数等各项指标，生根率用卡平方法作独立性测验，其他各项指标均按照完全随机试验单向分组资料的方法做方差分析，并用邓肯氏新复极差法进行多重比较。调查同时，在显微镜下调查根毛发生状况并拍照。

2 结果与分析

2.1 不同细胞分裂素对G.11试管苗增殖培养的效果

由表1可见，除6-BA浓度为1.5 mg/L处理外，其余3个6-BA浓度处理的新生茎尖数均显著高于各KT浓度处理和未添加激素的对照，而4个6-BA浓度处理之间的新生茎尖数差异不显著，4个KT浓度处理之间以及与对照之间的新生茎尖数差异也不显著。结果表明，6-BA可以明显促进G.11试管苗茎段萌芽，进而增加分枝数量，并且浓度在0.5～2.0 mg/L范围内的6-BA对促进G.11试管苗茎段萌芽的效果无明显差异。在0.5～2.0 mg/L ，KT对G.11试管苗茎段的萌芽没有促进效果。

表1 不同细胞分裂素对G.11试管苗增殖的影响

KT浓度6-BA浓度新生茎尖数最大茎长繁殖系数玻璃化率/% mg·L-1mg·L-1个mm 0.00.0 0.83bc 1.42b0.90b0.0c 0.50.00.58c 2.75b0.92b0.0c 1.00.0 0.67bc 0.33b0.67b0.0c 1.50.00.50c 1.92b0.75b11.1c 2.00.0 0.83bc 3.00b1.10b0.0c 0.00.52.42a32.50a6.70a68.8b 0.01.02.25a33.13a6.30a86.0a 0.01.5 1.63ab34.38a5.60a86.7a 0.02.02.63a38.13a6.90a94.5a

注：表内同列字母不同表示5%水平差异显著。下同

从最大茎长看，4个6-BA浓度处理之间差异不显著，但都显著高于4个KT浓度处理及对照，4个KT浓度处理及对照之间差异均不显著。这一结果表明6-BA不仅可以明显促进G.11试管苗茎段萌芽，而且也可以明显促进新生茎的生长。而KT对G.11试管苗茎段新生茎的生长也没有促进作用。

由于6-BA可以明显促进G.11试管苗茎段萌芽及新生茎的生长，因此提高了繁殖系数，表1中4个6-BA浓度处理的繁殖系数均显著高于各KT浓度处理，6-BA各浓度处理之间差异不显著，KT各个浓度处理之间及对照之间差异也不显著。

从试管苗的玻璃化状况看，4个6-BA浓度处理的玻璃化率均显著高于KT处理及对照，而且随着6-BA浓度增加玻璃化率有增高的趋势，6-BA浓度1.0～2.0 mg/L各处理的玻璃化率随6-BA浓度增加有所增高，但差异不显著，这3个浓度处理的玻璃化率均显著高于6-BA浓度0.5 mg/L处理。

综合上述分析，在MS培养基中，0.5～2.0 mg/L的KT对G.11试管苗茎段的萌芽及新生茎的生长均没有明显的促进效果，相同浓度范围的6-BA 则可以明显促进G.11试管苗茎段萌芽及新生茎的生长，进而明显提高试管苗的繁殖系数（图1）。但是6-BA各浓度处理的试管苗的玻璃化率较高，并且随6-BA浓度增加玻璃化率有增高的趋势。

图1 不同细胞分裂素对G.11试管苗增殖的影响

注：从左至右激素含量为：0.0，KT 0.5，KT 1.0，KT 1.5，KT 2.0，6-BA 0.5，6-BA 1.0，6-BA 1.5，6-BA 2.0 mg/L

2.2 不同培养基对G.11试管苗增殖的影响

由表2可见，在WPM培养基上G.11试管苗的新生茎尖数略高于MS培养基，但两者差异不显著。在MS培养基上G.11形成的最长茎的长度显著高于WPM培养基，表明MS培养基在促进G.11试管苗茎生长方面明显优于WPM培养基。MS培养基的繁殖系数略高于WPM培养基，但差异也不显著，而MS培养基上试管苗的玻璃化率则高达86.0%，显著高于WPM培养基。

表2 WPM与MS培养基对G.11试管苗增殖的影响

培养基种类新生茎尖数最大茎长繁殖系数玻璃化率 个mm% MS2.6a33.1a6.3a86.0a WPM2.9a16.0b4.3a0.0b

综合上述分析，WPM培养基上G.11试管苗的繁殖系数可以达到4.3并与MS培养基上的试管苗无显著差异，而且试管苗的玻璃化率为0，明显低于MS培养基，因此WPM培养基比MS培养基更适合用于G.11试管苗的增殖培养（图2）。

图2 G.11试管苗

注：左为WPM培养基，右为MS培养基

2.3 WPM培养基中6-BA浓度对G.11试管苗增殖的影响

由表3可见，6-BA浓度为1.0 mg/L处理的新生茎尖数最多为3.8个，显著高于其他处理，所有添加6-BA处理的新生茎尖数均显著高于未添加激素的对照，表明6-BA明显促进了G.11试管苗茎段腋芽的萌发以分生出新茎尖，并且以1.0 mg/L的6-BA促进萌芽的效果最好。

在最大茎长方面则以0.5 mg/L 6-BA浓度处理最长，显著长于6-BA浓度1.0、1.5 mg/L处理和对照。所有添加6-BA处理的最大茎长均显著长于对照。这些结果表明，添加6-BA不仅促进了萌芽，也可促进新生茎的生长，并且0.5 mg/L 6-BA对新生茎生长的促进效果明显优于1.0和1.5 mg/L等较高浓度的6-BA。

所有添加6-BA处理的繁殖系数均显著高于对照，而3个添加6-BA的处理之间的繁殖系数则差异不显著，分析其原因，可能是0.5 mg/L 6-BA处理虽然新生茎尖数较少，但新生茎较长，而较高浓度的6-BA处理的新生茎长较短而新生茎较多，因此，这就导致了各处理最终形成的可以用于再次接种的茎段总数差异不明显。

从试管苗的玻璃化率看，6-BA浓度为0.5 mg/L时的玻璃化率为0，当6-BA浓度增加到1.0 mg/L时玻璃化率显著增加。6-BA浓度为1.5 mg/L时玻璃化率虽有增加但与1.0 mg/L处理差异不显著。

综上所述，在WPM培养基中加入浓度为0.5 mg/L的6-BAG.11试管苗增殖效果较好，繁殖系数可达4.9，而且无玻璃化现象，6-BA使用量也较小，有利于降低成本，因此，该处理为本试验最佳处理。

表3 WPM培养基中6-BA浓度对G.11试管苗增殖的影响

6-BA浓度新生茎尖数最大茎长繁殖系数玻璃化率 mg·L-1个mm% 0.00.4d 1.8c1.3b0.0b 0.52.7c19.2a4.9a0.0b 1.03.8a15.7b5.9a29.2a 1.53.4b12.7b5.1a42.7a

WPM培养基中不同6-BA浓度处理的G.11试管苗生长状况如图3所示。

图3 WPM培养基中不同6-BA浓度对G.11试管苗生长的影响

注：由左至右6-BA浓度为：0.0、0.5、1.0、1.5 mg/L

2.4 G.11试管苗的土壤支撑生根培养效果

由表4可见，黏壤土与砂壤土做培养基支撑物处理的试管苗的生根率分别为76.7%和75.9%，两者均高于琼脂做培养基支撑物的处理，但卡平方测验表明，3个处理之间的生根率差异均不显著。琼脂做培养基支撑物处理的根长和根数均显著高于两个土壤支撑物处理。3个处理的茎长和叶数均无显著差异。

通过显微镜下对根系表面的观察，发现两种土壤支撑物处理的根系表面均生有大量根毛，而琼脂支撑物处理的根表面基本上无根毛。

综合上述分析，黏壤土和砂壤土做培养基支撑物的处理虽然在根长与根数方面明显低于琼脂支撑物处理，但是生根率、茎长及叶数等指标与琼脂支撑物处理无明显差异，而且试管苗根系表面生有根毛，根系形态结构优于琼脂支撑物处理。因此，在G.11试管苗生根培养中，可以用黏壤土或砂壤土替代琼脂做培养基支撑物，以降低成本，并为试管苗的带坨移栽奠定基础。

表4 不同培养基支撑物对G.11试管苗生根培养的影响

培养基支撑物生根率根长根数茎长叶数 %mm个mm个 黏壤土76.70a124.80b2.60b12.80a4.80a 砂壤土75.90a99.90b2.40b12.90a4.80a 琼脂56.25a284.33a5.55a10.25a10.59a

图4、图5分别为3种培养基支撑物处理的G.11试管苗生根和根毛发生状况。

图4 3种培养基支撑物处理的G.11试管苗生根状况

注：左为黏壤土，中为砂壤土，右为琼脂。下同

图5 3种培养基支撑物处理的G.11试管苗根毛发生状况

3 讨论与结论

在苹果属植物试管苗的增殖培养中，通常采用促进腋芽分枝以形成丛生枝的方式进行，而培养基中使用的细胞分裂素主要是6-BA[9]。在苹果矮化砧木的组织培养快速繁殖中，也都使用以6-BA为主的培养基[3-8]。在一些草本植物中，在试管苗的增殖培养中使用KT做主要激素取得了较好的效果[10-12]，张翔宇等研究表明，0.4 mg/L的KT可以促进木本植物红豆杉茎段的萌芽[13]，但在苹果矮化砧木试管苗增殖培养中未见有使用KT的研究。本研究中，比较了6-BA与KT两种细胞分裂素对G.11试管苗增殖的影响，表明6-BA可以明显促进G.11试管苗腋芽分枝，这与已有的研究结果一致。本研究也表明KT对G.11试管苗增殖没有效果。因此，在G.11试管苗增殖培养中，应以使用6-BA为主。

试管苗玻璃化是植物离体快繁中的难题之一。试管苗的玻璃化受多方面因素影响，其中培养基中细胞分裂素或铵态氮浓度过高都会加剧试管苗的玻璃化[14]。邹恩强等研究表明，M.9试管苗玻璃化率随着培养基中BA浓度的提高而提高，并且当MS培养基中铵态氮减少约一半时玻璃化率明显降低[15]。本项研究中，无论使用MS培养基还是使用WPM培养基，G.11试管苗的玻璃化率都随着6-BA浓度的增加而呈现升高的趋势，这一结果与邹恩强等的研究一致。本项研究中，在WPM培养基中试管苗的玻璃化率明显低于MS培养基，可能是WPM培养基中铵态氮的含量明显少于MS培养基的缘故，对此有待于进一步研究。

试管苗的生根培养一般分为瓶内生根与瓶外生根两种方式[16]。苹果矮化砧木试管苗的瓶内生根培养目前都是在琼脂培养基中进行的[3-8]。这种生根方式具有成本较高、移栽困难等不足。柴慈江等以土壤做培养基支撑物进行珠美海棠试管苗的生根培养，显著提高了试管苗的生根率，试管苗生有根毛，而且试管苗可以带坨移栽并显著提高成活率[17]。以土做培养基支撑物还可以将试管苗的生根培养放在温室或露地环境中进行[18-22]，从而进一步降低成本。本项研究以黏壤土和砂壤土做培养基支撑物进行G.11试管苗生根培养，虽然根长低于琼脂培养基中的试管苗，但是生根率与琼脂培养基中培养的试管苗无显著差异，而且试管苗生有根毛，这与柴慈江等的研究结果基本一致[17]。

综上所述，本项研究初步得出以下结论：6-BA可以明显促进G.11试管苗茎段萌芽与增殖，KT则对此无效；与MS培养基相比，WPM培养基可以显著降低G.11试管苗的玻璃化率；在含有6-BA 0.5 mg/L的WPM培养基中G.11试管苗的繁殖系数可达到4.9，玻璃化率为0；在以黏壤土或砂壤土做培养基支撑物的培养基中，G.11试管苗的生根率分别为75.9%和76.7%，而且试管苗生有根毛，根系结构优于琼脂培养基中的试管苗。本结果将为建立G.11离体快繁技术体系提供依据。

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Micro shoot proliferation and rooting of apple rootstock G.11

GUO Jing1, CHAI Ci-jiang1,Corresponding Author, SHI Yan-shan1, LUO Jian-xia1, JIANG Wen2

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. Tianjin Cherry Valley Agricultural Technological Development Co. Ltd, Tianjin 301908, China）

The stem sections of apple rootstock G.11 plantletwere respectively inoculated in MS media with different concentrations of 6-BA or KT, or inoculated in WPM media with different concentrations of 6-BA for proliferation. The stem sections were respectively inoculated in soil supporting media for rooting. The results showed that 6-BA promoted G.11 micro stem sections budding and proliferation obviously,while KT had no effect on this. Compared with MS medium, WPM medium reduced vitrification rate of G.11 plantletsignificantly. In WPM medium containing 0.5 mg/L of 6-BA, micro shoot multiplication coefficient of G.11 was 4.9 and vitrification rate was 0. Rooting rate of the G.11 micro shoot cultured in clay soil or sandy soil supporting media were 75.9% and 76.7%, respectively. Moreover, the plantlet had root hair. These results provide basic data for establishing the micro rapid propagation technique of G.11.

apple rootstock G.11; micro shoot; multiplication; rooting

1008-5394（2019）04-0038-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.008

S604.3；S723.123.6

A

2019-07-16

天津市林果现代农业产业技术体系创新团队项目（ITTFPRS2018002）

郭静（1996-），女，本科在读，主要从事园艺植物组织培养方面的研究。E-mail：1062594710@qq.com。

柴慈江（1960-），男，教授，硕士，主要从事园艺植物组织培养方面的研究。E-mail：cijiang666@163.com。

责任编辑：杨霞