二维相关谱技术在荧光谱重叠峰解析中的应用

张婧，柳春雨，连增艳，杨延荣，孙国红，杨仁杰

二维相关谱技术在荧光谱重叠峰解析中的应用

张婧，柳春雨，连增艳，杨延荣，孙国红，杨仁杰通信记者

（天津农学院 工程技术学院，天津 300384）

多环芳烃是重要的环境污染物，环境中的多环芳烃残留量低、种类繁多，常规荧光光谱法难以对复杂体系中的多环芳烃重叠荧光峰进行有效解析。采用二维荧光相关谱方法对苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[k]荧蒽三种多环芳烃的混合溶液进行荧光峰解析。配置三种多环芳烃混合溶液，共30个样本，并采集其随浓度变化的一维动态荧光谱。在此基础上，以浓度为外扰，分别对动态荧光谱进行同步和异步二维相关谱计算。以一维荧光光谱图中未被覆盖的500 nm苯并[ghi]苝荧光峰为线索，根据同步谱中交叉峰的正负和异步谱中交叉峰的有无，推断出405、425、459和491 nm处的荧光峰来自于苯并[a]芘；471、480和500 nm处的荧光峰来自于苯并[ghi]苝；417、433和443 nm处的荧光峰来自于苯并[k]荧蒽。研究结果表明，二维荧光相关谱技术可以实现复杂体系中多种多环芳烃重叠荧光峰的有效解析，能够提供更多的光谱特征信息。

二维荧光相关谱技术；苯并[a]芘；苯并[ghi]苝；苯并[k]荧蒽；重叠峰；解析

多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是由两个或两个以上的苯环以稠环或非稠环形式相连接的烃类化合物[1]，大部分PAHs具有致癌性、致畸性和致突变性，是重要的环境和食品污染物。环境中的PAHs主要来源于化石燃料的燃烧等人类活动，石油开采、石化产品的生产和运输过程也会造成环境中的PAHs污染[2]。PAHs在环境中的残留量比较低，但是分布较广泛，能以气态或颗粒态存在于大气、水体、土壤和植物中。对环境中PAHs的检测已受到很多专家的重视。鉴于PAHs是具有多个苯环的闭合共轭结构，荧光产生效率较高[3]，可使用荧光光谱分析法对PAHs进行检测。但在成分复杂的体系中，多环芳烃荧光峰重叠严重，常规荧光光谱法不能对其进行有效解析。二维荧光相关谱技术将光谱信号扩展到二维上，可对含有重叠峰的复杂光谱进行简化，极大地提高了光谱分辨率。并且这种技术能提供各信号峰之间变化的相关关系，有利于研究分子内和分子间的相互作用[4]。

二维相关技术最早于1986年由Noda提出[5]。2000年，Nakashima等率先将二维相关技术与荧光光谱法结合，对PAHs混合溶液的荧光特性进行了研究，指出该技术可以对PAHs重叠峰进行分辨[6-7]。2003年，Nakashima等[8]又利用二维荧光相关谱技术对胶束溶液中蒽和芘衍生物进行光谱分析，结果表明当在二维荧光相关光谱中采用猝灭扰动时，异步谱可有效增强光谱分辨率。国内对于此技术的研究也取得了较好的成果，利用二维荧光相关谱技术实现了多组份多环芳烃混合溶液中重叠荧光峰的解析[9-11]。此外，Yang等[12]提出了一种基于二维荧光相关谱定量检测环境中多环芳烃的新方法，并取得较好的分析结果。

本文采用二维荧光相关谱方法，以浓度为外扰，构建苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[k]荧蒽混合溶液的同步和异步二维荧光相关谱，根据同步谱中交叉峰的正负和异步谱中交叉峰的有无，对3种多环芳烃的重叠峰进行解析。该研究不仅为PAHs特征荧光信息库的建立提供试验基础，也为复杂体系中多种多环芳烃的同时分析提供一种可行性方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

试验所用仪器为美国Perkin Elmer公司生产的LS-55型号荧光分光光度计，以脉冲氙灯为光源。采用1 cm具塞石英比色皿。扫描条件：激发狭缝10.0 nm，发射狭缝10.0 nm，扫描速度1 000 nm/min，光电倍增管电压700，滤波器350 nm cut-off。选取350～580 nm波段范围扫描样品的荧光光谱。

试验所用3种试剂均由Accu Standard厂家提供，以乙腈为溶剂的苯并[a]芘溶液，浓度为100 mg/L；以丙酮为溶剂的苯并[ghi]苝溶液，浓度为100 ug/mL；以甲醇为溶剂的苯并[k]荧蒽溶液，浓度为100 ug/mL，纯度均为分析纯。

1.2 样品配置

采用逐步稀释法，将苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[k]荧蒽3种试剂分别用超纯水稀释成浓度为1×10g/L的储备液于容量瓶中备用。移取不同量的3种单组份储备液和一定量的超纯水混合，配置成3种混合溶液体系，共30个样品。样品No.1～No.9组成体系一，苯并[ghi]苝浓度递减（5×10-5～6×10-6g/L），苯并[a]芘、苯并[k]荧蒽浓度递增（5×10-6～4×10-5g/L）；样品No.10～No.18组成体系二，苯并[k]荧蒽浓度递增（1×10-6～3×10-5g/L），苯并[a]芘、苯并[ghi]苝浓度递减（3×10-5～1×10-6g/L）；样品No.19～No.30组成体系三，苯并[a]芘浓度递减（5×10-5～6×10-6g/L），苯并[ghi]苝、苯并[k]荧蒽浓度递增（5×10-6～4×10-5g/L）。

1.3 二维荧光相关谱计算

假设原始常规一维荧光光谱（×）包含个光谱，根据二维相关Noda理论[13-15]，基于式（1）和（2）进行相关计算，可分别得到同步和异步二维相关谱矩阵（ν1, ν2）和（ν1, ν2）。

式中为阶方阵，即为Hilbert-Noda矩阵，其矩阵元为

2 结果与分析

图1是浓度为1×10-5g/L的3种单组份多环芳烃水溶液的一维荧光光谱图。苯并[a]芘有3个荧光峰，分别在405、425和459 nm处；苯并[ghi]苝有2个荧光峰，分别在471和500 nm处；苯并[k]荧蒽有2个荧光峰，分别在417和433 nm处。图2是3种多环芳烃的混合溶液（浓度均为1×10-5g/L）在238 nm波长光激发下的一维荧光光谱图。除了苯并[ghi]苝在500 nm处的肩峰可以分辨出来之外，3种多环芳烃的其他荧光峰都被覆盖或淹没。因此，常规荧光光谱法无法有效区分出3种多环芳烃的特征峰。

图1 单组份多环芳烃一维荧光光谱图

图2 混合溶液一维荧光光谱图

对混合溶液体系一的9个样品，以浓度为外扰，以平均谱为参考谱，根据公式（1）和公式（2）分别进行同步和异步二维荧光相关谱计算，得到体系一的同步（图3a）和异步（图3b）二维荧光相关谱，图3c是异步谱在425 nm处的切谱。

图3a 体系一同步谱

图3b 体系一异步谱

图3c 体系一异步425 nm处切谱

对于同步二维荧光相关谱，在主对角线405、425、471、480和500 nm处存在自相关峰，表明此波长处的荧光峰强度随外扰的变化而变化。在主对角线外侧（500，480）、（500，471）nm处存在正交叉峰，表明3个荧光峰强度随外扰变化方向相同，其可能来自混合溶液中的同一组份。由于混合溶液中苯并[ghi]苝浓度在减小，苯并[a]芘和苯并[k]荧蒽浓度在增大，再结合500 nm处苯并[ghi]苝的峰（未被覆盖），可推断480和471 nm处的荧光峰也来自混合溶液中的苯并[ghi]苝；在（480，405）和（480，425）nm处存在负的交叉峰，表明405和425 nm处的荧光峰强度随外扰的变化方向与480 nm处变化方向相反，表明405和425 nm处荧光峰可能来自混合溶液中的苯并[a]芘或苯并[k]荧蒽。

对于异步二维荧光相关谱，在（500，480）、（500，471）nm处不存在交叉峰，表明3个荧光峰强度随外扰变化的速率相等，进一步证实了471、480和500 nm处荧光峰来自同一组份，都来自混合溶液的苯并[ghi]苝；（471，405）、（471，417）、（471，425）、（471，433）、（471，459）和（471，491）nm处存在交叉峰，表明471 nm处荧光峰强度与405、417、425、433、459和491 nm处荧光峰强度变化速率不同，表明471 nm处的荧光峰与其他6个峰的来源不同，由于471 nm处的峰来自苯并[ghi]苝，可推测405、417、425、433、459和491 nm处荧光峰来自混合溶液中的苯并[a]芘或苯并[k]荧蒽。此外，（491，433）和（491，443）nm处的交叉峰表明，491 nm处的荧光峰与433和443 nm处峰的来源不同。从图3c异步谱425 nm处切谱上可以看到，425 nm与417、433、471和500 nm之间都存在交叉峰，而425 nm与405、459 nm之间不存在交叉峰，可推测417和433 nm处荧光峰来源相同，405、425和459 nm处荧光峰来源相同，但对于具体来源还需要进一步分析。

对于体系二动态光谱进行同步和异步相关计算。对于同步二维荧光相关谱（图4a），在主对角线405、471和500 nm处存在自相关峰。主对角线外侧存在一些正交叉峰，分别位于（471，405）、（471，425）和（471，500）nm处，表明405、425、500 nm处与471 nm处的荧光峰强度随外扰的变化方向相同。由于该混合溶液体系中苯并[ghi]苝和苯并[a]芘的浓度在减小，苯并[k]荧蒽的浓度在增大，再结合上述分析结果（471和500 nm峰来自苯并[ghi]苝，且与405和425 nm峰来源不同），可推测出405和425 nm处的荧光峰来自于混合溶液中的苯并[a]芘。因405、425和459 nm处荧光峰来源相同，推测459 nm处峰也来自苯并[a]芘。

对于异步二维荧光相关谱（图4b）中，在（405，425）nm处不存在交叉峰，表明两峰荧光强度随外扰变化速率相同，进一步确认两峰来源相同，都来自混合溶液的苯并[a]芘。图4c为异步谱在471 nm处的切谱，可以看到471 nm与417、443 nm之间存在交叉峰，结合上述分析结果（471 nm峰来自苯并[ghi]苝，425 nm峰来自苯并[a]芘，417和433 nm处荧光峰来源相同），可推测417和433 nm荧光峰来自混合溶液中的苯并[k]荧蒽。因433和443 nm处峰与471 nm和491 nm两处峰来源都不相同，推测491 nm处峰来自混合溶液中的苯并[a]芘，443 nm处峰来自苯并[k]荧蒽。

图4a 体系二同步谱

图4b 体系二异步谱

图4c 体系二异步471 nm处切谱

图5a和图5b为体系三的异步二维相关荧光谱和在433 nm处的切谱，从图5a、5b可知，433 nm与405、425、471和500 nm处存在交叉峰；471 nm与405、425、433、443和459 nm处存在交叉峰，进一步验证和确认：混合溶液中405、425、459和491 nm处荧光峰来自苯并[a]芘，417、433和443 nm处荧光峰来自苯并[k]荧蒽，471、480和500 nm处荧光峰来自苯并[ghi]苝，解析结果与单组份荧光峰（图1）位置一致。

图5a 体系三异步谱

图5b 体系三异步433 nm处切谱

3 结论

采用二维荧光相关谱方法对苯并[a]芘、苯并[ghi]苝和苯并[k]荧蒽混合溶液中的重叠荧光峰进行解析。研究结果表明：二维荧光相关谱方法解析出的各物质的荧光峰位置与单组份一维荧光谱图中各物质荧光峰的位置相符，并且能够解析出更多的荧光特征信息。该方法操作简单，具有较强的光谱分辨能力，是一种对混合体系中多环芳烃重叠荧光峰进行解析的有效方法。

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Implementation of fluorescence spectral overlap resolution using two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy

ZHANG Jing, LIU Chun-yu, LIAN Zeng-yan, YANG Yan-rong, SUN Guo-hong, YANG Ren-jieCorresponding Author

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）, which have low residual amounts and various types, are important environmental pollutants. It is difficult to analyze the overlapping fluorescent peaks of PAHs in complex systems by conventional fluorescence spectroscopy. Two-dimensional（2D）fluorescence correlation spectroscopy was used to analyze the fluorescence peaks of a mixture of three PAHs, benzo[a]pyrene, benzo[ghi]pyrene and benzo[k]fluoranthene. A total of 30 mixed solution samples were prepared, and the one-dimensional（1D）fluorescence spectra were collected. On this basis, synchronous and asynchronous 2D correlation spectra were calculated for the 1D dynamic fluorescence spectra under the external disturbance of PAHs concentration. Based on the uncovered fluorescence peak of benzo[ghi]perylene at 500 nm in 1D fluorescence spectra, the sources of overlapping peaks were confirmed in mixed solutions in terms of the positive and negative cross peaks in synchronous spectra and the presence or absence of cross peaks in asynchronous spectra. The fluorescence peaks at 405, 425, 459 and 491 nm were assigned to benzo[a]pyrene; the fluorescent peaks at 471, 480 and 500 nm were assigned to benzo[ghi]perylene; the fluorescent peaks at 417, 433 and 443 nm were assigned to benzo[k]fluoranthene. The results showed that 2D fluorescence correlation spectroscopy can effectively resolve the overlapping fluorescent peaks of PAHs in complex systems and provide more spectral characteristics information.

two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy; benzo[a]pyrene; benzo[ghi]perylene; benzo[k]fluorene; overlapping peak; resolution

1008-5394（2019）04-0095-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.019

O657.33

A

2019-06-12

国家自然科学基金面上项目（41771357, 21607114, 31201359）；天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（18JCYBJC96400，14JCYBJC30400）

张婧（1995-），女，硕士在读，主要从事光谱检测方面的研究。E-mail：15737313523@163.com。

杨仁杰（1978-），男，教授，博士，主要从事光谱检测技术与应用方面的研究。E-mail：rjyang1978@163.com。

责任编辑：杨霞