蓝莓休眠花芽蛋白质双向电泳体系的建立和优化

吕晨菲，王茂思，黄唯子，杨静慧，刘艳军，黄俊轩

蓝莓休眠花芽蛋白质双向电泳体系的建立和优化

吕晨菲，王茂思，黄唯子，杨静慧通信作者，刘艳军，黄俊轩

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300384）

为建立适合蓝莓花芽的蛋白质双向电泳技术体系，以天津市蓟州区主栽蓝莓品种‘布里吉塔’休眠花芽为试材，采用TCA/丙酮法提取蓝莓休眠花芽蛋白质，选择5种蛋白质上样量（2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mg）、2种聚焦电压（8 000、10 000 V）、3种聚焦时间（6、7、8 h）进行双向电泳，R-250考染后，进行图谱比较分析。结果表明，蛋白质上样量3.00 mg，聚焦电压8 000 V，聚焦时间为8 h，可得到蛋白数目多、分辨率高的蓝莓休眠花芽双向电泳图谱。建立了适合蓝莓休眠花芽蛋白质的双向电泳体系，为开展蓝莓蛋白质组学分析研究奠定了基础，更为蓝莓花芽休眠及解除休眠分子机制的研究提供了理论依据与技术支撑。

蓝莓；花芽；蛋白质；双向电泳

蓝莓是重要的经济型小浆果类果树，具有较高的营养价值及保健功效，是近年我国发展最快的果树之一[1]。但蓝莓不耐贮藏，自然成熟的果实成熟期短而集中，无法实现周年供应[2]。促成栽培是通过人工加温的方法使蓝莓提前成熟，延长鲜果的货架期，供应淡季市场，提高果实商品价值，为农民实现创收。而蓝莓促成栽培的关键，是其休眠花芽是否完全解除了自然休眠。随着后基因组时代的到来，蛋白质组学研究已成为前沿领域[3]，通过双向电泳技术可以从分子水平上了解蓝莓花芽休眠及解除机制，在实际生产中，通过分子生物学技术的应用，导入相关的蛋白/基因，最终达到人工调控蓝莓休眠的目的。

双向电泳（2-DE）技术是蛋白质组学研究成功的前提和关键[4]，利用差异蛋白质组学获得的差异蛋白点可以反映植物在不同条件下的生理状态及其调控机制，已成为生物学研究的热点。

目前，关于果树双向电泳体系研究很多[5]。朱飞冀等优化了芒果叶片双向电泳体系[6]；冯浩等探究了苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系[7]；王瑞璞等建立了葡萄种子蛋白质双向电泳体系[8]，但并未发现有关蓝莓双向电泳体系的研究。不同植物的生物学特性、生理生化特征有很大差异，到目前为止，没有一种双向体系可以通用于所有试材[9]。因此，结合不同植物和不同材料组织的特点摸索出最佳的双向电泳条件显得至关重要。本研究通过对蓝莓休眠花芽蛋白质上样量、聚焦电压、聚焦时间等双向电泳条件进行探索，以期获得分辨率、重复性高的2-DE图谱，为开展蓝莓蛋白质组学分析奠定基础，更为蓝莓花芽休眠及解除休眠分子机制的研究提供理论依据与技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2018年11月中旬于天津市蓟州区马伸桥蓝莓试验基地，选取8年生健壮、无病虫害的‘布里吉塔’蓝莓的休眠花芽，即刻液氮处理，并保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 蛋白质样品的制备与定量

1.2.1 蛋白质提取

参照Carpentier等[10]的TCA-丙酮法进行。

（1）沉淀：在装有花芽粉末的15 mL离心管中加入1 mL 100%三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、4 mL 0.07%β-巯基乙醇丙酮溶液（-20 ℃预冷），充分振荡混匀后置于-20 ℃沉淀过夜；

（2）清洗：4 ℃，7 800 r/min离心30 min后弃上清。沉淀中加4 mL丙酮（-20 ℃预冷）以及1 mL 0.07%β-巯基乙醇丙酮溶液（-20 ℃预冷），并重悬沉淀。重复此过程直至上清液接近无色透明。清洗完成后弃上清液，将沉淀暴露在-20 ℃环境中使丙酮完全挥发。将得到的蛋白质干粉末分装于2 mL离心管中（装至管体积的1/4处）。

1.2.2 蛋白质裂解

在蛋白质粉末中加入1 mL裂解液（0.48 g的8 mmol/L尿素，0.15 g的2 mmol/L硫脲，0.04 g的4%CHAPS，加去离子水溶解并定容至1 mL），剧烈震荡混匀后，放入超声清洗仪进行清洗（25 ℃，40%功率，5 min），结束后取出剧烈震荡30 s，重复此过程8次后进行离心（4 ℃，12 000 r/min，30 min），取上清液。

1.2.3 蛋白质浓度的测定

选用Bradford法[11]进行测定。

1.3 双向电泳与图谱分析

1.3.1 水化上样

采用GE公司24 cm、pH3-10的IPG胶条，被动水化方式上样。根据测得的样品蛋白浓度（7.96 mg/mL），分别吸取200、250、300、350、400 μL蛋白样品溶液，加IPG buffer原液2.5 μL、1%溴酚蓝溶液0.5 μL并用去离子水补齐体积，总计450 μL。

1.3.2 一向IEF电泳

IEF聚焦程序设定：Step1～Step3（100 V，0.5 h；500 V，0.5 h；1 000 V，1 h）是低压除盐过程；Grd1-Grd3（2 000 V，0.5 h；6 000 V，2 h；10 000 V，2 h）是梯度升压过程；Step4（8 000/10 000 V，48 000/56 000/64 000 V）是等电聚焦过程；Step5（500 V，12 h）是保存胶条。将一向完成的胶条冲洗并进行2步平衡[12]。

1.3.3 二向SDS-PAGE电泳

取出胶板，冲洗擦拭并转移至聚丙烯酰胺凝胶（12.5%，厚1.5 mm）界面，排除气泡，用加热后的20%低熔点琼脂糖（含溴酚蓝）封胶。

首先用低功率1 W/gel（600 V，400 mA，0.5 h），当样品完全走出IPG胶，浓缩成一条线后，加大功率为13 W/gel（600 V，400 mA，7 h），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘停止电泳。

1.3.4 蛋白质染色与凝胶扫描分析

将胶块放入20%TCA固定液处理1 h。再用CBB-R250染色液（2.5 g CBB-R250；450 mL无水乙醇；100 mL冰乙酸；450 mL去离子水）染色4 h。随后用脱色液（250 mL无水乙醇；80 mL冰醋酸；670 mL去离子水）脱色至背景清晰（期间每4 h更换一次脱色液，脱色时间约为12 h）。

脱色完成后的凝胶使用Image Scanner III扫描仪进行扫描。扫描后的图像使用Adjust Contrast功能进行图像调整。

2 结果与分析

2.1 蓝莓休眠花芽蛋白质双向电泳上样量的优化

图1为蓝莓休眠花芽蛋白质在5种不同上样量条件下，凝胶图像效果的比对。图1a上样量为2.00 mg，蛋白质点数量少、颜色浅；图1b上样量为2.25 mg，背景干净，蛋白点圆润清晰，但数量仍较少；图1c上样量为2.50 mg，出现明显的横纵条纹，蛋白点数量增多，分布均匀，但颜色较浅；图1d上样量为2.75 mg，背景较干净，条纹有所缓解，蛋白质点分布均匀且颜色适中，但小分子蛋白质点较少；图1e上样量为3.00 mg，蛋白质点数量明显增多，特别是小分子量蛋白质点增加较多，且背景条纹减少。综上，上样量为3 mg时，蛋白质点圆润清晰，蛋白质点数量最多，横纵纹现象减轻，拖尾较轻，电泳效果最好，满足试验要求。

图1 不同上样量的比较

注：a：2.00 mg，b：2.25 mg，c：2.50 mg，d：2.75 mg，e：3.00 mg

2.2 蓝莓休眠花芽蛋白质双向电泳聚焦电压优化

图2a和图2b分别是在8 000 V、10 000 V电压条件下聚焦8 h的电泳图。图2a蛋白质点圆润清晰，背景干净，点的拖尾情况很少，满足试验要求。图2b的蛋白质点虽清晰，但由于电压太高，导致蛋白质漂移，出现了蛋白质点减少，且背景不如图2a干净。综上，选择8 000 V聚焦电压进行试验效果最佳。

图2 不同聚焦电压的比较

注：a：8 000 V，b：10 000 V

2.3 蓝莓休眠花芽蛋白质双向电泳聚焦时间优化

8 000 V电压下不同聚焦时间的电泳图如图3所示。图3a聚焦时间为6 h，背景有明显阴影、纵纹和横纹，以纵纹为界，左侧无蛋白点出现，分析原因可能是聚焦时间不足；图3b增加聚焦时间至7 h，横纵纹现象明显减轻，且蛋白质点分布均匀、圆润清晰，但背景仍不够干净；图3c增加聚焦时间至8 h后，背景变得清晰，蛋白质点清晰规整，横纵纹现象稍有增加，但是并不影响后续的软件分析效果。综上，选择8 h聚焦时间最佳。

图3 不同聚焦时间的比较

注：a：6 h，b：7 h，c：8 h

3 讨论

3.1 上样量对2-DE图谱的影响

蓝莓休眠花芽相对于叶片等高度分化的植物组织，具有很强的分化能力，蛋白质成分复杂，小分子蛋白质量多，提高电泳上样量有利于样品中低丰度蛋白质的检出。但若上样量过高，则易引起蛋白质聚集和沉淀，导致高丰度蛋白质重叠，掩盖低丰度蛋白质的表达[13-14]。因此合适的上样量应使2-DE图谱蛋白质点数的增加与图谱质量之间取得平衡。上样量的多少与样品种类、上样方式、IPG 胶条长度及 pH范围等因素相关[6]。在样品种类（蓝莓休眠花芽）、pH 3～10、24 cm IPG胶条、考染、被动水化等电泳条件均确定的情况下，应选择适宜上样量来提高蓝莓休眠花芽2-DE体系低丰度蛋白的检测。鉴于试材蛋白质浓度测定值在6.7～7.2 mg/mL，而GE公司pH 3～10、24 cmIPG胶条的推荐上样体积为450 μL，所以理论的蓝莓休眠花芽蛋白质样品的最大上样量应为3.24 mg，但IPG buffer、溴酚蓝等必然会占据一定的体积，GE的操作说明中也推荐加入水分，因此，本试验设置了5个梯度递增的蛋白质样品上样量（最大值小于3.24 mg）进行比对试验。多次重复试验发现，当上样量为3.00 mg时，低丰度蛋白质点最多，且最清晰，最大程度的满足了蓝莓休眠花芽，对检出大量低丰度蛋白质点的诉求，为后期试验的准确进行，提供了保障。

3.2 聚焦电压对2-DE图谱的影响

Wildgruber等，丁永强等[15-16]研究发现，等电聚焦电压对蛋白质在 IPG 胶条中均匀分布和进一步2-DE电泳分离有着直接的影响。在确定了蓝莓休眠花芽蛋白质提取方法、蛋白质样品最佳上样量的前提下，可根据试验材料的不同，调整聚焦电压，进行有效的除杂处理，缓解图谱中横纵条纹的产生，优化电泳体系。陈剑成等[17]研究凹叶厚朴叶片蛋白2-DE时，发现10 000 V的聚焦电压最合适；宋学东等[18]对白桦花芽蛋白质进行2-DE时发现，8 000 V是最佳聚焦电压；谢进等[19]研究毛白杨芽2-DE时，发现聚焦电压为4 000 V达到最佳聚焦效果。本研究发现，在其他电泳条件均一致的前提下，蓝莓休眠花芽蛋白聚焦电压采用8 000 V时，所得 2-DE图谱分辨率好，蛋白点形状圆润规则，横纵扩散纹理均有所缓解，聚焦效果佳。

3.3 聚焦时间对2-DE图谱的影响

等电聚焦时间是蛋白质电泳体系的一个重要参数[20]。如果聚焦时间过短，蛋白不能移动到其对应的pI点，2-DE图谱容易出现横条纹；聚焦时间过长，易导致蛋白质向阴极移动[21]。邱智敏等[22]研究油茶雌蕊蛋白2-DE时发现，聚焦时间7.75 h聚焦效果最佳；欧高政等[23]研究‘四季蜜’龙眼花芽蛋白2-DE时发现，聚焦时间5 h时高丰度和低丰度蛋白都有较好的分离效果；叶婕等[24]研究金钗石斛花芽蛋白2-DE，发现9 h聚焦充分，蛋白质点清晰。综上可知，在其他电泳条件均相同的情况下，通过等电聚焦时间的调整，可以使聚焦更充分，从而提高了蛋白质点的分离效果。本试验中发现，蓝莓休眠花芽蛋白在8 000 V聚焦电压，聚焦6 h条件下，横向条纹明显，蛋白质聚焦不完全，将聚焦时间增加到8 h，图谱分辨率较高，小分子蛋白质点数量增多，聚焦效果明显改善。

4 结论

以蓝莓休眠花芽为试材，建立了适用于蓝莓休眠花芽蛋白质的双向电泳体系：TCA/丙酮法提取蛋白质，选用24 cm pH 3～10线性胶条和12.5% SDS-PAGE胶分离蛋白质，上样量3.00 mg，聚焦电压8 000 V，聚焦时间8 h，考马斯亮蓝R250染色，得到的双向电泳图谱背景清晰，分辨率高。

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Establishment and optimization of two-dimensional electrophoresis system for proteins in dormant flower-bud of blueberry

LÜ Chen-fei, WANG Mao-si, HUANG Wei-zi, YANG Jing-huiCorresponding Author, LIU Yan-jun,HUANG Jun-xuan

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to establish a protein two-dimensional electrophoresis system suitable for blueberry flower -bud, taking the dormantflower bud of 'Brigita', the main blueberry variety in Jizhou District of Tianjin as the test material, selectingfive protein samples volumes（2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00 mg）, two focusing voltages（8 000, 10 000 V）and three focusing times（6, 7, 8 h）for two-dimensional electrophoresis,the chromatographic patterns after R-250 Coomassie brilliant blue dyeingwere compared and analyzed.. The results showed that, when the sample volumes was 3.00 mg, the focusing voltage was 8000 V and the focusing time was 8 h, which can obtain a high resolution electrophoresis map with a large number of protein spots. A two- dimensional electrophoresis system suitable for blueberry dormant flower bud protein was established, which laysa foundation for the development of blueberry proteomics analysis, and providestheoretical basis and technical support for the study of molecular mechanism of blueberry flower bud dormancy and dormancy release.

blueberry; flower bud; protein; two-dimensional electrophoresis

1008-5394（2019）04-0016-04

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.004

S667.201

A

2019-05-05

天津市科学技术局项目（16YFZCNC00750）；天津市重大农业技术推广项目（2017CK0184）；天津市林果现代产业技术体系创新团队项目（ITTFPRS2018002）；天津市科技特派员项目（17ZXBFNC0031，18JCTPJC68000）

吕晨菲（1995-），女，硕士在读，研究方向：果树引种、栽培研究。E-mail：1787410311@qq.com。

杨静慧（1961-），女，教授，博士，研究方向：园艺植物栽培、抗逆生理和分子育种研究。 E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。

责任编辑：杨霞