不同溶媒注射用还原型谷胱甘肽的肌肉刺激性实验

潘望平，邬姗，吕晓君，何开勇

(湖北省药品监督检验研究院生物安全检测中心，武汉 430064)

注射用还原型谷胱甘肽是用于抗癌药物解毒、放疗损伤预防，对酒精性肝中毒和各种原因引起的肝损伤有保护作用[1-2]。肌肉刺激实验是肌内注射类药物的安全性评价检查项目之一[3]，为保证其临床用药的安全、有效，本研究参照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》的要求对其进行肌肉刺激实验[4-6]。注射用还原型谷胱甘肽在临床使用中是用注射用水或0.9%氯化钠注射液溶解后进行注射，因此本实验比较3个厂家的受试药品用两种溶媒配制的供试液对家兔的肌肉刺激结果，评价其安全性，为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1受试药品 注射用还原型谷胱甘肽3批：受试药品1，规格：每支0.6 g，批号：31504231，武汉大安制药股份有限公司生产；受试药品2，规格：每支0.6 g，批号：14021180，重庆药友制药有限责任公司生产；受试药品3，规格：每支0.6 g，批号：131159，意大利福斯卡玛生化制药公司生产(原研对照制剂)。人临床肌肉注射拟用最高浓度为0.3 g·mL-1。溶媒A：0.9%氯化钠注射液(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，规格：每瓶100 mL，批号：140307703)；溶媒B：灭菌注射用水(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，规格：每瓶100 mL，批号：130922-1)。

1.2仪器 动物秤(型号：XS6001S，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；BX53 型显微镜(日本Olympus 公司)。

1.3实验动物 普通级日本大耳白兔96只，雌雄不限，体质量为2.3～2.8 kg，由武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2011-0011。家兔饲养于湖北省药品监督检验研究院，普通环境，温度为16～26 ℃，相对湿度40%～70%，实验动物使用许可证：SYXK(鄂)2014-0009。

1.4动物分组 96只家兔按体质量随机区组设计方法分成12组，每组8只，按不同生产厂家、溶媒、剂量分别编号为1A-H、1A-L、1B-H、1B-L、2A-H、2A-L、2B-H、2B-L、3A-H、3A-L、3B-H、3B-L，见表1。

1.5受试药品溶液配制 取注射用还原型谷胱甘肽6支，加0.9%氯化钠注射液或注射用水至12 mL，浓度为0.3 g·mL-1(大剂量组)；取注射用还原型谷胱甘肽3支，加0.9%氯化钠注射液或注射用水至12 mL，浓度为0.15 g·mL-1(小剂量组)。

1.6给药方法 采用同体左右侧自身对比法。剪去两侧股四头肌部位的兔毛，消毒皮肤后，家兔左侧股四头肌给予受试药品溶液，右侧股四头肌给予溶媒。注射体积均为每侧1 mL，单次给药[7-8]。

1.7观察指标 于给药后72 h，每组取4只家兔处死，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察肌肉组织的颜色、光泽，有无充血、水肿、变性或坏死，按肌肉刺激反应分级标准计算相应的反应级，并取两侧注射部位肌肉组织，常规处理，作组织病理学检查；于给药后14 d，每组处死剩余4只家兔，同法剖检观察局部反应并进行组织病理学检查，以了解肌肉刺激反应的持续状况或可逆性。

表1家兔的随机区组设计方法

Tab.1Randomizedblockdesignmethodofrabbits

组别生产厂家溶媒剂量编号1武汉大安0.9%氯化钠注射液大剂量1A-H2武汉大安0.9%氯化钠注射液小剂量1A-L3武汉大安注射用水大剂量1B-H4武汉大安注射用水小剂量1B-L5重庆药友0.9%氯化钠注射液大剂量2A-H6重庆药友0.9%氯化钠注射液小剂量2A-L7重庆药友注射用水大剂量2B-H8重庆药友注射用水小剂量2B-L9意大利福斯卡玛0.9%氯化钠注射液大剂量3A-H10意大利福斯卡玛0.9%氯化钠注射液小剂量3A-L11意大利福斯卡玛注射用水大剂量3B-H12意大利福斯卡玛注射用水小剂量3B-L

1.8结果判定标准 根据肌肉刺激反应分级标准计算肌肉刺激性总反应级，计算平均值，判定刺激等级，并结合组织病理学检查的结果进行综合评价。肌肉刺激反应分级标准：无明显变化，0分；轻度充血，其范围在0.5 cm×1.0 cm以下，1分；中度充血，其范围在0.5 cm×1.0 cm以上，2分；重度充血，伴有肌肉变性，3分；出现坏死，有褐色变性，4分；出现广泛性坏死，5分。平均分值为0.0～0.4，无刺激；0.5～1.4，轻微刺激；1.5～2.4，轻度刺激；2.5～3.4，中度刺激；3.5～4.4，重度刺激；4.5及以上，严重刺激。

2 结果

2.1肉眼观察及评分结果 结果见图1，2和表2。家兔肌肉注射给药72 h后，0.9%氯化钠注射液溶媒对照组家兔肌肉组织未见异常(图1A)，无肌肉刺激反应；注射用水溶媒对照组家兔肌肉有中度到重度充血(图1B)，肌肉刺激反应平均分值为3.0～3.25，说明注射用水作为溶媒对照有中度肌肉刺激反应。受试药品1(武汉大安)、受试药品2(重庆药友)、受试药品3(意大利福斯卡玛)用0.9%氯化钠注射液配制的大剂量药液在给药后72 h后，家兔出现不同程度的肌肉刺激反应(图1C，1G，1K)，平均分值分别为2.25，3.25，1.25，刺激反应分级分别为轻度、中度、轻微；而用注射用水配制的大剂量药液对家兔肌肉刺激反应平均分值分别为3.5，3.75，3.5，刺激反应分级均为重度刺激(图1D，1H，1L)。受试药品1、受试药品2、受试药品3用0.9%氯化钠注射液配制的小剂量药液对家兔的肌肉刺激反应平均分值分别为0，0.5，0，刺激反应分级分别为无、轻微、无(图1E，1I，1M)；而用注射用水配制的小剂量药液对家兔肌肉刺激反应平均分值分别为3.0，3.0，3.5，刺激反应分级均为中度刺激(图1F，1J，1N)。家兔肌肉注射给药14 d后，受试药品2用0.9%氯化钠注射液配制的大剂量组有1只家兔的注射部位出现白色增生组织(图2A)，用注射用水配制的大剂量组4只家兔均出现肌肉变性、增生结节组织(图2B)；0.9%氯化钠注射液溶媒对照组、注射用水溶媒对照组、受试药品1和受试药品3用两种溶媒配制的大、小剂量组、受试药品2用两种溶媒配制的小剂量组家兔肌肉组织肉眼观察均未见异常。

2.2组织病理学检查结果 家兔肌肉注射给药后72 h肌肉组织病理学检查结果如图3所示。0.9%氯化钠注射液溶媒对照组的给药部位肌纤维组织结构完整，无变性、坏死，未见炎症细胞浸润现象(图3A)，注射用水溶媒对照组的给药部位肌纤维坏死，中度出血及大量炎症细胞浸润(图3B)。受试药品1、受试药品2、受试药品3用0.9%氯化钠注射液配制的大剂量药液在给药后72 h后家兔注射部位肌肉组织出现不同程度的出血、炎症细胞浸润和肌纤维变性坏死，其中受试药品2肌纤维坏死程度及范围最严重(图3G)、受试药品1 其次(图3C)、受试药品3最轻(图3K)；用注射用水配制的大剂量药液组家兔注射部位肌肉组织均出现大量出血及炎症细胞浸润，肌纤维大范围坏死、溶解、变性(图3E，3I，3M)。受试药品1、受试药品2、受试药品3用0.9%氯化钠注射液配制的小剂量药液组家兔注射部位肌肉组织病理学检查均未见明显异常(图3D，3H，3L)；而用注射用水配制的小剂量药液组家兔注射部位肌肉组织均出现中度出血、炎症细胞浸润和肌纤维变性(图3F，3J，3N)。家兔肌肉注射给药后14 d肌肉组织病理学检查结果如图4所示。受试药品2用0.9%氯化钠注射液配制的大剂量组有1只家兔的注射部位出现结缔组织增生并形成结节(图4A)，用注射用水的大剂量组4只家兔注射部位均有不同程度结缔组织增生并形成结节(图4B)；0.9%氯化钠注射液溶媒对照组、注射用水溶媒对照组、受试药品1和受试药品3用两种溶媒配制的大、小剂量组、受试药品2用两种溶媒配制的小剂量组家兔注射部位肌肉组织病理学检查均未见异常。

A.0.9%氯化钠注射液组；B.注射用水组；C.1A-H受试药品组；D.1B-H受试药品组；E.1A-L受试药品组；F.1B-L受试药品组；G.2A-H受试药品组；H.2B-H受试药品组；I.2A-L受试药品组；J.2B-L受试药品组；K.3A-H受试药品组；L.3B-H 受试药品组；M.3A-L受试药品组；N.3B-L受试药品组

图1家兔给药后72h肌肉刺激肉眼观察结果(1：2.5)

A.0.9% sodium chloride injection group；B. water for injection group；C. test drug 1A-H group；D. test drug 1B-H group；E. test drug 1A-L group；F. test drug 1B-L group；G. test drug 2A-H group；H. test drug 2B-H group；I. test drug 2A-L group；J. test drug 2B-L group；K. test drug 3A-H group；L. test drug 3B-H group；M. test drug 3A-L group；N. test drug 3B-L group

Fig.1Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation72hoursafterintromuscleinjection(1：2.5)

表2家兔给药后72h肌肉刺激反应积分和分级

Tab.2Scoresandgradingofmuscularstimulationresponseofrabbits72hoursafterintromuscleinjection

组别家兔/只左侧(受试药品)每只家兔积分平均分等级右侧(溶媒)每只家兔积分平均分等级1A-H组433122.25轻度00000无1A-L组400000无00000无1B-H组444333.50重度33343.25中度1B-L组433333.00中度33333.00中度2A-H组433343.25中度00000无2A-L组411000.50轻微00000无2B-H组444433.75重度33343.25中度2B-L组433333.00中度34333.25中度3A-H组422101.25轻微00000无3A-L组400000无00000无3B-H组433443.50重度33343.25中度3B-L组433333.00中度33333.00中度

组别：1.武汉大安；2.重庆药友；3.意大利福斯卡玛；A.0.9%氯化钠注射液；B.注射用水；H.大剂量；L.小剂量

Groups：1.Wuhan，daan； 2.Chongqing，yaoyou； 3.Italy，Foscama；A.0.9% sodium chloride injection； B.water for injection； H.high dose； L.low dose

A.2A-H受试药品组； B.2B-H受试药品组

图2家兔给药后14d肌肉刺激肉眼观察结果(1：2.5)

A. test drug 2A-H group；B. test drug 2B-H group

Fig.2Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation14dayafterintromuscleinjection(1：2.5)

3 讨论

本实验观察3个不同厂家的注射还原型用谷胱甘肽分别用0.9%氯化钠注射液和注射用水溶解后对家兔进行单次给药的肌肉刺激作用：受试药品设置大、小两个剂量，给药后72 h和14 d进行大体观察评分和组织病理学检查，以比较两种溶媒配制的受试药品对家兔肌肉刺激有无差异，并比较3个不同厂家的受试药品的肌肉刺激性。结果显示，根据给药后72 h的大体观察结果及组织病理学检查结果进行分级，0.9%氯化钠注射液作为溶媒时，受试药品1(武汉大安)、受试药品2(重庆药友)、受试药品3(意大利福斯卡玛)大剂量组肌肉刺激反应分别为轻度、中度、轻微，小剂量组肌肉刺激反应分别为无、轻微、无；注射用水作为溶媒时，大剂量组肌肉刺激反应均为重度，小剂量组肌肉刺激反应均为中度，说明用注射用水作为溶媒配制受试药品比0.9%氯化钠注射液作为溶媒的肌肉刺激反应大，且大剂量比小剂量的肌肉刺激反应大，其中受试药品2的肌肉刺激性最大，受试药品1其次，受试药品3最小。给药14 d后，大体观察和病理学结果表明，受试药品2大剂量对家兔所致的肌肉刺激为不可逆，家兔肌肉有结缔组织增生和白色结节，且用注射用水作为溶媒配制受试药品比0.9%氯化钠注射液作为溶媒导致的不可逆损伤更为严重；受试药品1和受试药品3对家兔的肌肉刺激性为可逆的。受试药品3为意大利福斯卡玛生化制药公司生产，是注射还原型用谷胱甘肽原研对照制剂，在本次实验中肌肉刺激性最轻，提示我国仿制药品与原研药还是存在差别。

3个不同厂家的注射用还原型谷胱甘肽的肌肉刺激结果均显示注射用水作为溶媒比0.9%氯化钠注射液的肌肉刺激性大，可能是因为用注射用水配制的药液为低渗溶液，短时、快速地进入肌肉组织后引起肌细胞肿胀、溶解至72 h后发生变性坏死；而用0.9%氯化钠注射液配制的药液为等渗溶液，注射后肌肉刺激较注射用水轻；且注射用水溶媒组亦出现中度肌肉刺激性。因此，用注射用水配制的药液引起的肌肉刺激反应可能有一部分是来自注射用水而不仅仅是受试药品，可认为用注射用水配制注射用还原型谷胱甘肽，加重其肌肉刺激反应，建议在临床使用时用0.9%氯化钠注射液进行配制。

A.0.9%氯化钠注射液组；B.注射用水组；C.1A-H受试药品组；D.1A-L受试药品组；E.1B-H受试药品组；F.1B-L受试药品组；G.2A-H受试药品组；H.2A-L受试药品组；I.2B-H受试药品组；J.2B-L受试药品组；K.3A-H受试药品组；L.3A-L受试药品组；M.3B-H受试药品组；N.3B-L受试药品组

图3家兔给药后72h肌肉组织病理图(HE染色，×100)

A.0.9% sodium chloride injection group；B. water for injection group；C. test drug 1A-H group；D. test drug 1A-L group；E. test drug 1B-H group；F. test drug 1B-L group；G. test drug 2A-H group；H. test drug 2A-L group；I. test drug 2B-H group；J. test drug 2B-L group；K. test drug 3A-H group；L. test drug 3A-L group；M.test drug 3B-H group；N. test drug 3B-L group

Fig.3Histopathologicalimagesofrabbitsmuscle72hoursafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

A.2A-H受试药品组； B.2B-H受试药品组

图4家兔给药后14d肌肉组织病理图(HE染色，×100)

A. test drug 2A-H group；B. test drug 2B-H group

Fig.4Histopathologicalexaminationofrabbitsmuscle14daysafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

综上所述，注射用还原型谷胱甘肽用0.9%氯化钠注射液做溶媒比注射用水的肌肉刺激反应轻，且原研制剂的肌肉刺激最轻。为保障公众用药安全和提升我国仿制药质量提供实验参考依据。