天名精提取物对小鼠免疫功能的影响*

林力，王强，周玉丹，万京桦，周国祥，徐佳琪，王子涛，肖硕，辛祖超

(1.武汉科技大学医学院职业危害识别与控制湖北省重点实验室、感染免疫与肿瘤微环境研究所，武汉 430065；2.枝江市人民医院，枝江 443200)

天名精为菊科植物天名精CarpesiumabrotanoidesLinnaeus的干燥全草，在湖北广泛分布，具有清热化痰、解毒杀虫、破瘀止血的功效，主要用于治疗乳蛾喉痹、急慢惊风、牙痛、疔疮肿毒、痔瘘、皮肤痒疹、毒蛇咬伤、虫积、血瘕、吐血、血淋、创伤出血等症[1]。同时，天名精也是一味很著名的民族药，在白族、傈僳族、藏族、土家族和苗族均可药用[2]。其主要含有倍半萜内酯类成分，具有抗菌消炎、抗病毒、杀虫、免疫调节等药理作用[3-4]。倍半萜类化合物被报道有抗肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管新生的功效[4-6]。笔者通过研究天名精提取物对小鼠免疫器官、巨噬细胞吞噬功能、溶血空斑形成情况影响，从免疫学角度讨论了天名精提取物对机体免疫功能影响。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级健康昆明种雄性小白鼠75只，体质量(23±2) g，鼠龄4～5周，由武汉科技大学动物医学中心提供，动物使用许可证号：SYXK(鄂)2012-0067，动物合格证号：42000600025754。小鼠同组同笼饲养，各组基础日粮相同，自由进食，自然昼夜节律光照。实验动物饲养室温度(23±1) ℃，相对湿度(50±10)%，通过空调风机与外界实现通风换气。

1.2药品与试剂 天名精全草于2017年8月采集于湖北省枝江市，经中南民族大学药学院杨新洲教授鉴定为菊科植物天名精CarpesiumabrotanoidesLinnaeus，药材标本(编号SC0811)存于中南民族大学药学院标本馆。天名精提取物的制备：取干燥的天名精粉末500 g，倒入5000 mL圆底烧瓶中，加入2500 mL石油醚，电热套加热回流提取3 h，滤过，滤渣中加入石油醚2500 mL，继续加热回流3 h，滤过，再重复前两次操作，合并3次提取所得滤液，浓缩，得12.5 g石油醚部位。所剩滤渣重复石油醚部位提取操作，分别加入乙酸乙酯和甲醇，每种溶剂分别提取3次，每次3 h，合并相同的提取滤液，减压浓缩干得到乙酸乙酯提取物26.7和43.9 g甲醇提取物。乙酸乙酯(中国医药集团总公司，批号：U1265400)；甲醇(中国医药集团总公司，批号：40030560)；石油醚(60～90 ℃，批号：816690)；亚甲基蓝溶液(珠海贝索生物技术公司，批号：416082)；营养肉汤培养基(杭州微生物试剂公司，批号：YJ-135004)；可溶性淀粉(武汉洪山中南化工试剂公司，批号：2901613)；小牛血清Hanks液(武汉生物制品研究所提供，批号：KA13136)；补体(武汉生物制品研究所提供，批号：160102)；绵羊红细胞(武汉生物制品研究所提供)；鸡红细胞混悬液的制备：于无菌操作下，取鸡翅静脉血置于三角烧瓶中，加入相当血液量5倍的Alserver's液，混合均匀后，4 ℃贮存[7]。临时用时吸取红细胞用0.9%氯化钠溶液洗3次，离心速度为3000 r·min-1，离心半径为45 cm，离心时间为10 min，直至红细胞压积稳定，然后用0.9%氯化钠溶液配置成1%鸡红细胞(red blood cell，RBC)溶液。

1.3主要仪器 平行蒸发仪(EZ-2 型，GeneVac公司)；低速离心机(北京医用离心机厂)；电子天平(上海天平仪器厂，感量：0.01 mg)；Nikon光学显微镜；电热套(上海坤盟仪器设备厂)。

1.4动物分组及给药方法 按随机数字表法将75只小鼠随机分为5组，每组15只，根据前期预实验结果进行了剂量确定，设立天名精乙酸乙酯提取物小剂量组、甲醇提取物小剂量组、天名精乙酸乙酯提取物大剂量组、甲醇提取物大剂量组和空白对照组。采用灌胃方式给药，药物现配现用。空白对照组每天给予0.9%氯化钠溶液，天名精小、大剂量组按50，100 mg·kg-1给药，每天给药1次，连续10 d，每次1 mL。

1.5脾脏质量和脏器指数的测定 第10天对小鼠进行称质量后，立刻处死小鼠，然后取脾脏于电子天平称质量，记录数据后，计算脾脏脏器指数：脾脏脏器指数=免疫器官质量/体质量[8]。

1.6吞噬细胞功能检测 第7天将小鼠腹腔注射6%营养淀粉肉汤1 mL，刺激小白鼠腹腔产生无菌性炎症，诱导巨噬细胞的活化、聚集。第10天腹腔注射0.9%氯化钠溶液配制的1%鸡血细胞1 mL，30 min后注射2 mL小牛血清Hanks液稀释腹腔液，处死小鼠，立即剖腹，用尖头吸管冲洗小鼠腹腔液以收集尽可能多的巨噬细胞[9]。将腹腔液于洁净试管与1或2滴1%亚甲基蓝溶液混合，均匀涂抹于载玻片上，37 ℃温箱干燥，生物学显微镜油镜检测，计算吞噬指数和吞噬百分比：吞噬率(%)=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞)×100%；吞噬指数=200个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞。

1.7溶血空斑检测 第6天，将5%绵羊红细胞0.4 mL(约4×106个)腹腔注射到小鼠体内，第10天处死小鼠，剖腹分离脾脏，按文献[10]法测定小鼠溶血空斑形成情况。借助放大镜，进行空斑计数，计算1×106个脾细胞所含溶血空斑数。

2 结果

2.1天名精提取物对小鼠免疫器官的影响 与空白对照组比较，天名精乙酸乙酯提取物小、大剂量组与甲醇提取物小、大剂量组小鼠外周免疫器官脾脏质量与脏器指数均明显提高，差异有统计学意义(P<0.01)，天名精乙酸乙酯提取物和甲醇提取物小剂量组效果更佳。见表1。

2.2天名精提取物对小鼠腹腔巨噬细胞功能影响 与空白对照组比较，天名精乙酸乙酯提取物小、大剂量组与甲醇提取物小、大剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数均显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2，图1。

表15组小鼠脾脏质量和脏器指数比较

组别剂量/(mg·kg-1·d-1)脾脏质量/mg脏器指数空白对照组117.6±10.893.89±0.13乙酸乙酯 小剂量组50198.6±20.11∗15.94±0.62∗1 大剂量组100174.8±16.77∗15.39±0.47∗1甲醇 小剂量组50170.6±10.09∗15.30±0.30∗1 大剂量组100148.6±12.09∗14.46±0.29∗1

与空白对照组比较，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

2.3天名精提取物对小鼠溶血空斑形成影响 与空白对照组比较，天名精乙酸乙酯提取物小、大剂量组与甲醇提取物小、大剂量组溶血空斑形成数均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。说明天名精乙酸乙酯、甲醇提取物小、大剂量组均可显著促进小鼠溶血空斑的形成，天名精乙酸乙酯提取物和甲醇提取物小剂量组效果更好。见图2，表3。

表25组小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数比较

组别剂量/(mg·kg-1·d-1)吞噬率/%吞噬指数空白对照组35.49±1.640.37±0.06乙酸乙酯 小剂量组5056.60±3.97∗11.09±0.07∗1 大剂量组10050.80±3.96∗11.01±0.05∗1甲醇 小剂量组5053.40±3.20∗10.68±0.03∗1 大剂量组10057.40±1.34∗11.01±0.06∗1

与空白对照组比较，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

3 讨论

天名精全草四季可采摘，广泛分布于湖北地区。《神农本草经》中天名精被列为上品，入脾、胃、肝三经。本课题组制备了天名精的环己烷、乙酸乙酯、甲醇3种溶剂提取物。前期，运用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)测试各种提取物对肺癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、肝癌细胞株的体外抗肿瘤活性，结果显示天名精的乙酸乙酯、甲醇提取物对各种肿瘤细胞株具有广谱的抗癌效果(在浓度为20 μg·mL-1时，抑制率>50%)，其中对肝癌细胞株HepG2和Huh7的活性最强(5 μg·mL-1时，抑制率>95%)，且显示出良好的浓度-效应曲线关系。天名精提取物和所含的化学成分已显示抗菌、杀虫、抗炎、抗肿瘤等活性，但它对机体免疫功能的影响研究鲜见报道。基于此，课题组通过研究天名精乙酸乙酯、甲醇提取物对小鼠脾脏质量、免疫器官指数、腹腔巨噬细胞功能及溶血空斑形成情况的影响，探讨天名精提取物对小鼠特异性和非特异性免疫功能的作用。

A.空白对照组；B.乙酸乙酯小剂量组；C乙酸乙酯大剂量组；D.甲醇小剂量组；E.甲醇大剂量组

A.blank control group；B.low-dose ethyl acetate group；C.high-dose ethyl acetate group；D.low-dose methanol group；E.high-dose methanol group

Fig.1Detectiononthefunctionofperitonealmacrophagesinfivegroupsofmice(×1000)

A.空白对照组；B.乙酸乙酯小剂量组；C乙酸乙酯大剂量组；D.甲醇小剂量组；E.甲醇大剂量组

A.blank control group；B.low-dose ethyl acetate group；C.high-dose ethyl acetate group；D.low-dose methanol group；E.high-dose methanol group

Fig.2Detectionresultsofantibody-formingcellsinvitroinfivegroupsofmousespleens(×100)

表35组小鼠溶血空斑形成情况比较

组别剂量/(mg·kg-1·d-1)溶血空斑形成数空白对照组361±11.70乙酸乙酯 小剂量组501368±47.56∗1 大剂量组1001280±125.98∗1甲醇 小剂量组50498±42.10∗1 大剂量组100472±20.40∗1

与空白对照组比较，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

脾脏在出生后由造血器官演变为最大的外周免疫器官。脾脏是淋巴细胞定居的重要场所，其中B细胞占60%，T细胞占40%，脾脏还负责对血源性抗原产生免疫应答[11]。实验结果表明，天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物可促进小鼠脾脏生长、提高脾脏脏器指数，尤其是小剂量乙酸乙酯提取物、甲醇提取物效果更显著。巨噬细胞具有强大的吞噬能力和消化能力，是参与和促进炎症的重要细胞，是体内重要的抗原提呈细胞，巨噬细胞吞噬功能对非特异性免疫起着不可或缺的影响，其检测结果反映非特异性免疫功能强弱；溶血空斑的本质是介导体液免疫应答并产生抗体的B淋巴细胞，其检测结果能反映特异性体液免疫功能强弱[12]。实验结果显示，天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数、吞噬百分率，增强了机体的非特异性免疫功能，乙酸乙酯提取物以小剂量组效果更优，而甲醇提取物以大剂量效果更为显著。天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物促进了溶血空斑的形成，提高B细胞产生抗体的能力，增强机体的特异性体液免疫功能。天名精对机体免疫功能的促进作用，小剂量组效果更佳，这主要与中药的双向调节有关：在一定浓度内中药天名精可以增强机体免疫，当天名精剂量过高时，其增强机体免疫的作用就不如小剂量组。结果提示中药天名精既可以增强正常的免疫功能，又可以使免疫增强处于一定范围内，防止免疫功能过于亢进[13-14]。

天名精主要化学成分为萜类和黄酮类成分，萜类成分以单萜和倍半萜骨架为主，主要含有桉叶烷型倍半萜、吉玛烷型倍半萜、愈创木烷型倍半萜，另含有贝壳杉皖型二萜等结构类型；黄酮类以黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等骨架为主。倍半萜类化合物被报道过有抗肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管新生的功效。目前国内在天名精的开放应用研究还只是处于起步阶段，天名精主要化学成分开发前景仍在研究阶段，是否能成为人体抗肿瘤的化学新物质，亟待进一步开展研究。