3种中药成分对CYP2C9酶的影响*
2019-04-02范宰文马思琪徐爱军王亚蒂
范宰文，马思琪，徐爱军，王亚蒂
(华北理工大学基础医学院，唐山 063000)
随着中药现代化的发展，目前已有许多中草药进入了欧美市场，并且占了大量的市场份额，但同时也有许多报道指出中草药之间、中草药与化学药合并使用时可能存在危害性[1-3]。中草药有效成分在体内代谢酶作用下发生代谢转化的同时对酶也会产生抑制或诱导作用，引起合用药物药代行为的改变，产生代谢性相互作用。细胞色素P450(CYP)酶被抑制或诱导是引起代谢性药物相互作用并导致药物不良反应增加或疗效降低的重要原因[4]。CYP酶是最重要的一类药物代谢酶，参与75%临床药物的代谢，对CYP 酶的抑制或诱导是引起药-药代谢性相互作用的重要因素[2-3]。中药有效成分对CYP 酶的抑制能降低合用的其他中药成分或化学药物的体内代谢消除，打破合用药物与其代谢产物之间的平衡，升高血药浓度或引起蓄积，导致药物的药效增强乃至不良反应或毒性反应的发生[5-6]。因此，评价中药有效成分对CYP 酶的抑制活性，对于临床安全用药、降低药-药相互作用的风险有重要的意义。现有的文献报道以CYP3A4的研究最为多见；然而，CYP2C9亦为体内主要的药物代谢酶之一，特别是在抗凝药物华法林和抗癌药物紫杉醇等许多临床常用药的代谢中被广泛研究，具有重要地位[2-3]。含槲皮素、芍药苷和齐墩果酸等成分的中药在抗凝、抗癌或增强机体免疫力方面均有广泛应用，因此临床上极有可能发生药-药相互作用。鉴于此，笔者以CYP2C9酶为研究对象，应用探针底物法，选择3种中药成分槲皮素、芍药苷和齐墩果酸，采用大鼠肝微粒体模型，以甲苯磺丁脲(tolbutamide,TB)为探药，通过检测TB甲基羟基化的反应产物确定CYP2C9酶的活性，在体外评价了大鼠肝微粒体中3种常见中药有效成分对CYP2C9酶的抑制活性，为深入理解这些中药有效成分的代谢性质并阐明它们的药-药相互作用机制、避免不良的药物相互作用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1主要仪器 Waters 高效液相色谱仪、515泵、2487紫外检测器、Empower色谱数据工作站，均为美国Waters公司；Beckman Allegra-64R型低温高速离心机(美国Beckman公司)；TU-1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；PRO 200匀浆器(美国PRO Scientific公司)；华普达SHA-C水浴恒温振荡器(常州市华普达教学仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(上海医疗仪器五厂)；ZH-2涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)；梅特勒AE240电子分析天平(瑞士，感量：0.01 mg)；SANYO -80℃低温冰箱(日本)；BK-360B 超声波脱气机[济南巴克超声波科技(集团)有限公司]；N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司)；色谱柱：Symmetry C8柱(美国Waters，150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-醋酸铵缓冲液(pH值=5.25，1 mmol·L-1)，30：70；流速：1.0 mL min-1；柱温：30 ℃；检测器：紫外检测器；检测波长：230 nm。
1.2药品 槲皮素(批号：100081-200907)、芍药苷(批号：110736-201035)和齐墩果酸(批号：110709-200505)标准品均购自中国食品药品检定研究院；TB对照品(SIGMA-ALDRICH Co批号：080M1713V)；氯磺丙脲对照品(东京化成工业株式会社,批号：G101-RMFF)；羟基甲苯磺丁脲(hydroxytoluene sulfobutamide,HS)对照品(SPI bio Bertin Co，批号：M02009)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷辅酶Ⅱ(NADP+)；葡萄糖六磷酸(G-6-P)；葡萄糖六磷酸脱氢酶(G-6-PDH)分别购自Roche公司。
1.3动物 健康Wistar大鼠5只，雄性，体质量为180～220 g，SPF级，由华北理工大学实验动物中心提供，合格证号：1512125。许可证号：SYXK(京)2014-0004，在恒温(24±2)℃、光照周期12 h：12 h环境中饲养1周后实验。
1.4探针和阳性抑制剂储备液及工作液的制备 TB储备液和工作液(10 mmol·L-1)：取TB标准品约0.10 g，精密称定，置5 mL棕色量瓶中，加乙腈：水(1：1)溶解，并定容至刻度，制得80 mmol·L-1的TB储备液，另以乙腈：水(1：1)稀释得10 mmol·L-1的TB工作液，均置于4 ℃冰箱避光保存；HS储备液：精密称取HS标准品约2.5 mg，置10 mL容量瓶中，加乙腈：水(1：1)至刻度，溶解，即得250 μg·mL-1HS储备液，-20 ℃冰箱保存；磺胺苯吡唑工作液：取磺胺苯吡唑标准品约1.25 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇：水(1：1)定容，制成0.4 mmol·L-1的磺胺苯吡唑工作液，4 ℃冰箱避光保存；内标工作液(IS)：取氯磺丙脲标准品约10.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加纯乙腈至刻度，溶解，即得1 mg·mL-1工作液，4 ℃冰箱避光保存。分别精密称取槲皮素、芍药苷和齐墩果酸标准品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成5 mmol·L-1的3种中药有效成分工作液。
1.5肝微粒体的制备 取大鼠正常肝组织，用4 ℃ 0.15 mol·L-1氯化钾磷酸盐缓冲液反复冲洗，除净血污，称取肝脏组织剪成碎块，按1：4(W/V)比例加入上述0.15 mol·L-1氯化钾磷酸盐缓冲液，匀浆器制成肝匀浆。将制备好的匀浆在离心机上以5000 r·min-1(r=12.7 cm)的速度离心10 min，取上清液再以15 000 r·min-1(r=12.7 cm)的速度离心20 min，取上清液，最后以60 000 r·min-1(r=12.7cm)的速度离心60 min，弃去上清液，得粉红色沉淀(即肝微粒体)，将其悬浮于20%甘油磷酸盐缓冲液中，分装后放入-80 ℃冰箱中储存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。
1.6TB与肝微粒体的体外反应及HPLC法测定 孵育体系总体积100 μL，包含微粒体蛋白、0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值=7.4)，TB、5 mmol·L-1MgCl25 μL、10 mmol·L-1G-6-P 5 μL、1.5 mmol·L-1NADP+5 μL，置于10 mL具塞离心管中，37 ℃水浴预孵育3 min，加入葡萄糖六磷酸脱氢酶(1.38 U·mol-1)2 μL启动反应，30 min后加1 mol·L-1冰醋酸10 μL，终止反应，同时加入内标工作液5 μL，涡旋振荡30 s，加入提取液异丙醚2.5 mL，涡旋3 min，4000 r·min-1离心10 min，取上层有机相2 mL于另一试管中，在40 ℃时用氮吹仪吹干，用200 μL流动相复溶，涡旋3 min，10 000 r·min-1(r=12.7 cm)离心10 min，取50 μL进样进行HPLC色谱分析，每个浓度平行重复3次。
1.7磺胺苯吡唑抑制作用的研究 孵育体系总体积100 μL，含大鼠正常肝微粒体蛋白0.5 mg·mL-1，终浓度为1.2 mmol·L-1的TB，磺胺苯吡唑工作液(终浓度为10，5，2.5，1.3，0.625，0.325，0.15 625，0.08 125 μmol·L-1)，以下操作同“1.6”项，每个浓度平行重复3次。
1.8槲皮素、芍药苷和齐墩果酸对大鼠肝微粒体的抑制作用 以各中药有效成分置换孵育体系中的阳性抑制剂磺胺苯吡唑，各有效成分的系列浓度均为0. 25，0. 5，1，2. 5，5，10，50 和100 μmol·L-1，按上述”1.7”项下程序进行孵育，由不同浓度反应组底物代谢产物的生成率计算酶抑制率及半数抑制浓度(IC50)值[7]。
2 结果
2.1TB在大鼠肝微粒中的代谢及HPLC测定 不同浓度的TB分别与大鼠肝微粒体温孵30 min ，色谱图见图1 。由图1可见，TB与空白肝微粒体温孵液中的杂质峰及TB代谢物HS峰达到良好分离。HS的保留时间为3.8 min，内标的保留时间为7.8 min，TB的保留时间为19.2 min。在此色谱条件下，内标物氯磺丙脲和底物TB及其代谢产物HS均分离完全，没有干扰。HS的精密度的RSD<5%，最低检测限为0.125 μg·mL-1，在0.125～16 μg·mL-1之间线性关系良好；且HS的检测准确度较高，说明此方法具有良好的精密度和准确度。
2.2CYP2C9酶阳性抑制剂磺胺苯吡唑的酶抑制作用 CYP2C9酶阳性抑制剂磺胺苯吡唑在大鼠肝微粒体体系中均能明显地抑制CYP2C9酶介导的TB甲基羟基化反应，得到的抑制曲线呈S型特征，将浓度取对数后与抑制率(inhibition rate，IR)进行回归分析，得大鼠回归方程为Y=2.999 5X-1.752 7(34.52≤X≤75.02，R2=0.934 3)，见图2，计算IC50值为0.584 4 μmol·L-1，详见表1，该结果基本与文献报道的0.24～0.96 μmol·L-1一致[6]。
2.3槲皮素、芍药苷和齐墩果酸3种中药成分对CYP2C9的抑制作用 槲皮素、芍药苷、齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的IC50值比较，如表1 所示。研究表明，3种中药成分对CYP2C9均有一定的抑制作用。以磺胺苯吡唑为阳性对照，分别计算3种中药成分的抑制率结果：槲皮素、芍药苷和齐墩果酸抑制率见图3～5，3种中药活性成分的抑制曲线呈典型的S型。槲皮素、齐墩果酸和芍药苷的IC50分别为15.343，49.361和4.115 μmol·L-1。按照通用的CYP 酶抑制剂强度分级规则[8]，IC50<1 μmol·L-1为强抑制剂，1 μmol·L-1
3 讨论
笔者采用差速离心法制备大鼠肝微粒体，在体外模拟CYP2C9酶对TB代谢的实验并进行研究。以TB为探针，以CYP2C9酶的经典抑制剂磺胺苯吡唑为阳性对照，在体外模拟3种中药成分对CYP2C9酶的抑制作用。磺胺苯吡唑的抑制作用明显，所得IC50的值与文献所述基本一致(表1)。实验结果显示，随着时间的延长，产物量逐渐增加。但是5 min的孵育时间太短，不易操作，且代谢产物量较少，误差较大。随着时间的延长，产物增长率降低，导致代谢产物生成量与孵育时间不成比例增加，且30 min足够进行不同浓度抑制剂的比较，操作容易，故选择30 min的孵育时间。
中药有效成分对CYP 酶的抑制作用是引起代谢性药-药相互作用的重要因素之一[9]。中药多组分和多靶点的特性决定其相互作用机制的复杂性，对主要有效成分的酶抑制活性评价可以为深入认识中药合理配伍应用及其机制提供科学依据。有文献报道，银杏叶提取物中槲皮素对CYP2C9、CYP3A4有显著抑制作用[7]，穗花杉双黄酮对CYP2C9有抑制作用[10]，而白果内酯则通过诱导CYP2C加速S-华法林的代谢[11]。
A.肝微粒体空白对照图谱；B.肝微粒体加入内标氯磺丙脲(IS 0.05 mg·mL-1)图谱；C.肝微粒体代谢TB的图谱(TB 1.2 mmol·L-1)
图1大鼠肝微粒体代谢甲苯磺丁脲HPLC检测图谱
A.chromatography of blank control of liver microsome；B.chromatography of liver microsome spiked with chlorpropamide (IS,0.05 mg·mL-1)；C.chromatography of TB (1.2 mmol·L-1)metablized by liver microsome
Fig.1HPLCchromatographyoftolbutamidemetabolizedbylivermicrosomeofrats
图2磺胺苯吡唑对大鼠肝微粒体CYP2C9的抑制作用
Fig.2InhibitionofsulfaphenazoleonratCYP2C9inlivermicrosome
表1磺胺苯吡唑和3种中药成分对CYP2C9的IC50值
Tab.1IC50valuesofsulfaphenazoleandthreeherbalconstituentsonCYP2C9μmol·L-1
特殊抑制剂/成分IC50参考范围磺胺苯吡唑0.584 4±0.083 40.24～0.96槲皮素15.340 0±2.191 0-芍药苷49.360 0±7.051 0-齐墩果酸4.115 0±0.593 5-
图3槲皮素对大鼠肝微粒体CYP2C9的抑制曲线图
Fig.3InhibitarycurveofquercetinonratCYP2C9inlivermicrosome
图4芍药苷对大鼠肝微粒体CYP2C9的抑制曲线图
Fig.4InhibitarycurveofpaeoniflorinonratCYP2C9inlivermicrosome
图5齐墩果酸对大鼠肝微粒体CYP2C9的抑制曲线图
Fig.5InhibitarycurveofoleanolicacidonratCYP2C9inlivermicrosome
笔者采用不同浓度的中药有效成分，在大鼠肝微粒体中与探针底物共同温孵，通过计算IC50值对3种中药有效成分的酶抑制活性进行初步分级；结果显示：槲皮素、芍药苷和齐墩果酸3种有效成分对CYP2C9酶活性的抑制有较大差别，其中齐墩果酸对CYP2C9的抑制率大于70%； 芍药苷的抑制作用较弱。应用IC50值对3种中药有效成分的酶抑制活性进行初步分级，结合这些有效成分的体内血药浓度可以为临床药-药相互作用的预测提供参考。但是，这些有效成分在人体的酶抑制活性及机制还有待于在体内试验进一步研究。当临床上使用含齐墩果酸成分的中药及其制剂时，应尽量避免与经CYP2C9代谢的药物联合应用，如：氟伐他汀、氯吡格雷、厄贝沙坦、氯沙坦、华法林、替诺昔康、氯诺昔康、托拉塞米、格列美脲、格列吡嗪、双氯芬酸、布洛芬。如根据临床需要必须联合应用时，应关注CYP2C9介导的代谢性药物相互作用，特别是与治疗窗窄的药物联合应用时，避免由于齐墩果酸对CYP2C9的抑制作用，使联用药物的血药浓度增高，导致不良反应增加而产生不良后果，提高临床用药的安全性和有效性。
