表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒Snyder Hill株的构建及鉴定

李翠霞，王喜军，赵丹丹，帅 磊，步志高，葛金英

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的一种重要人畜共患传染病[1]，RV 能够引起人和哺乳动物的急性、渐进性、致死性脑膜脑炎，一旦发病100 %致死[2]。据估计，全球每年约5.9 万人死于狂犬病，其中95 %以上的死亡病例发生在亚洲和非洲，99 %以上的狂犬病死亡病例是由感染RV 的犬引起[3-5]。通过疫苗免疫减少动物感染狂犬病的风险是预防人感染狂犬病最有效的方法[6]。目前，兽用狂犬病疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗是应用最为广泛的狂犬病疫苗，但该疫苗生产成本较高，难以在发展中国家广泛应用。弱毒疫苗相比灭活疫苗价格低廉，但病毒可以在动物体内增殖存在毒力返强的风险，2017年我国农业部公告第2514 号文件规定自2017年7 月1 日起停止生产使用狂犬病活疫苗(包括多联活疫苗)。

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由CD 病毒(CDV)引起的在犬科、鼬科、浣熊科以及其它肉食动物之间广泛传播的急性、高度接触性和致死性的病毒性传染病[7]。该病呈季节性分布，可经气溶胶和飞沫传播，因易感动物种类不同，CDV 引起的致死率差异较大，病死率可从对家养猫的0 到对雪貂的100 %致死，而对家养犬的致死率约为50 %[8-9]。目前，CD 宿主范围不断扩大，呈世界性分布，给养犬业和皮毛动物养殖业造成重大的经济损失，也对野生肉食动物的种群数量造成严重威胁。疫苗免疫可以有效预防和控制CD 的发生，其中弱毒疫苗能够有效诱导动物机体产生体液和细胞免疫反应，在全球范围内使用最为广泛，但其主要是针对犬的免疫进行的研制，当对雪貂、水貂等其它肉食动物免疫时由于其毒力较强而易对其产生致死性感染。CD 灭活疫苗因诱导机体产生中和抗体水平低、持续时间短、不能对免疫动物产生完全保护作用已逐渐被淘汰，因此迫切需要研制一种更加安全有效的CD 疫苗。

反向遗传技术的不断发展和成熟为以单股负链RNA 病毒作为载体构建重组二联苗提供了基础[10-11]。近年来，利用CD 弱毒疫苗株为载体构建重组活载体疫苗已成为研究的热点。本研究以CDV Snyder Hill 疫苗株为载体，构建表达RV G 蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG，为研制经济、有效、安全的CDV-RV 二联苗开展探索性研究。

1 材料与方法

1.1 病毒株、细胞系和质粒 野生型CDV Snyder Hill 株由本实验室分离鉴定；BSR、BSR-S46 和Vero 细胞均由本实验室保存；原核表达载体pBlue-Script SK(+)、真核表达载体pCI 和含RV G 蛋白基因的重组质粒pCAGGs-RVG 均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 病毒RNA 提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；反转录试剂盒、Calcium Phosphate Kit 购自Invitrogen 公司；E.coliDH5α 感受态细胞、 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 购自Vazyme 公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega 公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自NEB 公司；RIPA 裂解液、核酶和蛋白酶抑制剂均购自Solarbio 公司；犬CDV 阳性血清和鼠RV 阳性血清均由本实验室保存；Cy5 纯化的山羊抗小鼠IgG 和兔抗犬FITC IgG 购自Jachson公司；CDV N 蛋白单克隆抗体(MAb)由军事兽医研究所提供；增强型化学荧光(Enhanced chemilumescent，ECL)显色液购自伯乐公司。

1.3 引物设计 参照GenBank 登录的CDV Snyder Hill 序列(JN896987)设计3 对引物，将全基因组分为末端重叠的3 个基因片段(F1、F2、F3)，在F1 片段上游引入锤头状核酶序列(Hammerhead ribozyme sequence，HamRz)，F3 片段末端引入丁型肝炎病毒核酶序列(Hepatitis delta virus ribozyme sequence，HdvRz)以确保转录产物末端与基因组cDNA 序列完全一致。在CDV 全基因组3 363 nt～3 378 nt 之间通过点突变引入PmeⅠ和MluⅠ酶切位点，并设计扩增辅助质粒N、P 和L 基因的上、下游引物以及扩增RV G 基因的上、下游引物(表1)，引物由吉林省库美生物合成。

1.4 含CDV Snyder Hill 株全基因组重组质粒pCICDV 的构建与鉴定 提取CDV Snyder Hill 株病毒RNA，反转录，根据其全基因序列(JN896987)，设计引物F1-F、F1-R、F2-F、F2-R、F3-F、F3-R(表1)，将CDV 全长分为3 段进行PCR 扩增， 每个片段重复4 次扩增，扩增产物经凝胶电泳检测后回收，并连接至质粒pBlueScript SK(+)，送由吉林省库美生物公司测序。通过SeqMan 软件分析各段基因序列后，将各基因片段逐段克隆至目的载体pCI质粒CMV-IE 启动子的下游，获得含CDV Snyder Hill 全基因组的质粒pCI-CDV (图1)。以pCI-CDV为模板，分别PCR 扩增CDV 的3 个基因片段，PCR 产物由吉林库美生物公司测序鉴定。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

图1 CDV Snyder Hill 株基因组全长cDNA 质粒构建示意图Fig.1 Schematic representation of the construction of full-length cDNA plasmids of CDV Snyder Hill strain

1.5 重组质粒pCI-CDV-RVG 和辅助质粒的构建与鉴定 通过点突变将CDV 全基因组3 363 nt～3 378 nt 之间的基因序列GCTTTCACTATCGCTT 突变为GTTTAAACTAACGCGT，引入PmeⅠ酶切位点，并将pCI-CDV 载体线性化。以本实验室保存的质粒pCAGGs-RVG 为模板，PCR 扩增出RV G 基因片段，测序后克隆至pCI-CDV 质粒的CDV 基因组P、M 基因之间，构建重组质粒pCI-CDV-RVG。以构建的pCI-CDV 为模板，扩增其N、P 和L 基因片段，分别克隆至pBlueScript SK(+)中，测序正确后分别克隆至线性化载体pCI 的CMV-IE 启动子下游，构建辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP 和pCI-CDVL。通过PCR 扩增鉴定3 个辅助质粒及pCI-CDV-RVG，PCR 产物分别进一步测序鉴定。

1.6 rCDV、rCDV-RVG 病毒拯救 采用磷酸钙转染法分别将质粒pCI-CDV (5 μg/ 孔)、pCI-CDVRVG (5 μg/ 孔)和辅助质粒pCI-CDVN (1 μg/ 孔)、pCI-CDVP (0.8 μg/孔)和pCI-CDVL (0.5 μg/ 孔)共转染密度为90%的BSR 细胞，12 h 后以1 mL/孔10%DMSO 休克各孔细胞2.5 min。转染后细胞继续培养，待出现细胞病变(CPE)时将其刮下并吹散混匀，取300 μL 细胞悬液加入至密度约为80 %的Vero 细胞中共培养，待出现CPE 后收集细胞及上清，并在Vero 细胞中继续传代培养，培养7 d 后收获病毒液，获得拯救的CDV Snyder Hill 株病毒及重组病毒，并分别命名为rCDV、rCDV-RVG。

1.7 重组病毒的RT-PCR 检测 采用RNA 提取试剂盒分别提取1.6 中经Vero 细胞传代培养获得的rCDV、rCDV-RVG RNA，并反转录为cDNA。以各病毒cDNA 为模板，以N-F/N-R 和RV G-F/RV G-R为引物(表1)， PCR 扩增rCDV 和rCDV-RVG 的N基因和rCDV-RVG 的G 基因，扩增产物经1 %琼脂凝胶电泳检测拯救获得的rCDV 和rCDV-RVG。

1.8 重组病毒的间接免疫荧光(IFA)检测 将rCDV和rCDV-RVG 分别以MOI=0.01 接种于BSR-S46 细胞，待细胞出现CPE 后以4 %多聚甲醛固定，分别以犬CDV 阳性血清(1∶100)、鼠RV 阳性血清(1∶100)为一抗，以兔抗犬FITC IgG (1∶200)、Cy5 纯化的山羊抗小鼠IgG (1∶200)为二抗，进行IFA 检测，DAPI(1∶1 000)对细胞核染色后在激光共聚焦显微镜下观察各病毒蛋白的表达。

1.9 重组病毒的western blot 检测 将rCDV 和rCDV-RVG 分别按MOI=0.01 接种于BSR-S46 细胞，待80 %细胞出现CPE 时弃上清，加入细胞裂解液裂解细胞40 min，分别以CDV N 蛋白MAb (1∶200)和鼠RV 阳性血清(1∶100)为一抗，以山羊抗小鼠HRP-IgG (1∶5 000)为二抗，利用western blot 检测各重组病毒。

1.10 病毒生长动力学曲线的测定 分别将rCDV、rCDV-RVG 按MOI 为0.01 接种于Vero 细胞，在感染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 和168 h分别收获病毒液并冻存于-70 ℃，取样结束后，将不同时间段收获的病毒液连续10 倍倍比稀释后以100 μL/ 孔的量接种于BSR-S46 细胞，每个稀释度分别做4 个重复，24 h 后用4 %多聚甲醛固定，分别以犬CDV 阳性血清(1 ∶100)、鼠RV 阳性血清(1∶100)为一抗，以兔抗犬FITC IgG (1∶200)、Cy5 纯化的山羊抗小鼠IgG (1∶200)为二抗，利用IFA 检测不同时间段的病毒滴度，采用GraphPad 软件绘制病毒生长曲线。

2 结 果

2.1 含CDV Snyder Hill 株全基因组重组质粒pCI-CDV 的构建与鉴定 PCR 分段扩增出CDV Snyder Hill 疫苗株的F1、F2、F3 基因片段，将其逐段克隆至pCI 质粒载体中，构建含CDV Snyder Hill株基因组全长cDNA 的质粒pCI-CDV。以pCI-CDV质粒为模板，PCR 分别扩增其F1、F2、F3 基因片段，结果显示扩增的基因片段大小均与预期一致，测序结果显示各基因片段序列均与其基因片段序列一致，表明正确构建了重组质粒pCI-CDV。

2.2 重组质粒pCI-CDV-RVG 和辅助质粒的构建与鉴定 将测序正确的RVG 基因克隆至载体pCI-CDV 中，构建重组质粒pCI-CDV-RVG。PCR 扩增RVG 基因，凝胶电泳显示扩增得到的片段与RVG 基因片段大小一致，表明构建了重组质粒pCI-CDV-RVG。以pCI-CDV 为模板，扩增CDVN、P 和L 基因片段并克隆至pCI 载体中，构建辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP 和pCI-CDVL。PCR 分别扩增该3 个质粒的N、P、L 基因片段均与预期片段大小一致，测序显示扩增的3 个基因序列均与各自基因序列一致。表明正确构建了3 个辅助质粒。

2.3 rCDV、 rCDV-RVG 的拯救 将质粒pCICDV、pCI-CDV-RVG 和3 个辅助质粒共转染BSR细胞，12 h 后休克细胞，接着利用5 % DMEM 培养，待细胞出现CPE 后与Vero 细胞共培养3 d 后观察可见Vero 细胞出现的融合现象与CDV 感染细胞后CPE 一致。表明拯救了rCDV、rCDV-RVG 病毒。

2.4 重组病毒RT-PCR 鉴定结果 将重组病毒rCDV-RVG 和rCDV 在Vero 细胞中连续传代后提取病毒RNA，并反转录为cDNA，以其为模板进行RT-PCR 鉴定。结果显示，经PCR 扩增均获得约1 500 bp 的目的条带，与预期各目的基因大小一致(图2)，初步表明拯救了重组病毒rCDV 与rCDVRVG。

2.5 重组病毒IFA 检测结果 将病毒rCDV、rCDV-RVG 感染BSR-S46 细胞，待出现CPE 时经IFA 检测。结果显示，采用犬CDV 阳性血清检测rCDV 出现特异性绿色荧光，而经鼠RV 阳性血清检测则为阴性；采用犬CDV 阳性血清和鼠RV 阳性血清检测rCDV-RVG 感染的细胞均出现特异性荧光，细胞对照孔均为阴性(图3)。结果表明，分别拯救了重组病毒rCDV 与rCDV-RVG，且后者在感染BSR-S46 细胞的复制过程中正确表达了RV G 基因。

图2 重组病毒RT-PCR 鉴定结果Fig.2 Identification of recombinant virus by RT-PCR

图3 RV G 蛋白在重组病毒rCDV-RVG感染细胞中表达的检测Fig.3 Identification for RV G protein expression in the cells infected with recombinant virus rCDV-RVG by IFA

2.6 重组病毒western blot 检测结果 rCDV 和重组病毒rCDV-RVG 感染BSR-S46 细胞后，western blot 鉴定结果显示，在rCDV 和rCDV-RVG 中均检测到了与N 蛋白大小一致的条带；而仅rCDV-RVG检测到约72 ku 的蛋白条带，与预期RV G 蛋白大小一致(图4)。表明RV G 蛋白能够在重组病毒rCDV-RVG 中稳定存在并正确表达。

2.7 病毒生长动力学曲线测定结果 将rCDV 和重组病毒rCDV-RVG 感染Vero 细胞，在感染后每间隔24 h 收获细胞培养上清，并测定各个时间段样品的病毒滴度，绘制生长曲线。结果显示，重组病毒rCDV-RVG 与亲本株rCDV 生长动力学曲线相似，虽然前者在Vero 细胞中的增殖水平稍低于亲本株rCDV (图5)，但经统计学分析，二者在Vero 细胞中的增殖水平差异不显著(p＞0.05)。表明外源基因RV G 的插入并未影响CDV Snyder Hill 株病毒的生长特性，其具备作为病毒活载体表达外源基因的潜力。

图4 Western blot 检测RV G 蛋白在重组病毒rCDV-RVG感染细胞中的表达Fig.4 Detection of RV G protein expression in the cells infected with recombinant virus rCDV-RVG by western blot

图5 rCDV-RVG 和rCDV 在Vero 细胞中的生长动力学曲线Fig.5 Growth curve of recombinant virus rCDV-RVG and rCDV in Vero cells

3 讨 论

随着反向遗传技术的不断发展和成熟，单股负链RNA 病毒已经成为活病毒载体研究的热点，该类病毒不仅能够作为载体表达外源基因，还能够表达提高机体免疫力的细胞因子。目前，水疱性口炎病毒(VSV)[12]、新城疫病毒(NDV)[13]和人副流感病毒(hPIV)[14]等作为疫苗载体的研究最广泛、深入。2000年，Gassen 等首次通过反向遗传操作技术从病毒基因组的cDNA 克隆中拯救出CDV 病毒[15]，为CDV 作为活病毒载体的研究奠定基础。本研究构建CDV Snyder Hill 株病毒反向遗传操作平台，为构建表达RV G 蛋白的重组活载体疫苗奠定基础。

G蛋白为RV 唯一的表面糖蛋白，可以与细胞受体结合刺激细胞免疫，诱导机体产生保护性中和抗体，其单独免疫即可诱导动物产生良好的免疫反应。以RV G 蛋白为免疫原制备的狂犬病糖蛋白DNA 疫苗可以诱导免疫小鼠产生较强的IgG，攻毒试验进一步表明以RV G 蛋白制备的RV DNA 疫苗具有良好的免疫效力[16]。Ge 等将RV ERA 株的G抗原基因插入到NDV La Sota 株基因组内，获得表达RV 抗原的重组活载体疫苗，该疫苗株能够诱导犬、猫产生强烈和持久的抗RV 中和抗体，以较低的剂量(108.3EID50)免疫就能使机体产生超过一年的完全保护作用[17]。因此，本研究选用RV 疫苗株G蛋白作为重组病毒中RV 的保护性抗原。

CDV基因组含有6 个独立转录单元，外源基因插入位点有7 个不同的选择，但选择外源基因插入位点的原则是既要保证外源基因的高效表达，又要确保病毒复制能力不受影响。根据单股负链RNA病毒“stop-start”转录机制及该机制存在的缺陷可知，越靠近基因组5' 末端，蛋白表达量越高，但影响下游基因的表达，对病毒的生长周期产生很大影响，从而降低病毒滴度。有研究表明，外源基因插入N 基因之前的非编码区无法得到重组病毒，而N、P 是构成核糖核蛋白颗粒(RNPs)的重要成分，且RNPs 各成分之间的比例对病毒的生长周期至关重要[18]，因此外源基因也不能插入N、P 之间，若插入M、F、L 基因之间的任何位置则外源基因的表达量均特别低。众多学者对CDV 作为载体表达外源基因的能力进行了探究，结果表明外源基因插入CDV 基因组P、M 之间的非编码区，既能够很好的表达外源基因，又不影响载体病毒的复制[15]，因此P、M 之间的非编码区成为外源基因插入的首选位点。本研究将RV G 基因插入CDV Snyder Hill 基因组P、M 的非编码区，拯救了重组病毒rCDVRVG，该重组病毒与亲本株rCDV 具有相似的生长特性，但病毒滴度略低于亲本株，这一结果在一定程度上表明外源基因的插入对CDV Snyder Hill 亲本病毒有一定的致弱作用。

近年来，以CDV 不同疫苗株为载体构建重组病毒的研究越来越多。王喜军等以CDV/R-20/8 为载体，构建表达RV G 蛋白的重组CDV，以106TCID50/mL 的剂量免疫犬两次后，免疫动物体内产生抗CDV 和RV 的中和抗体，并且可提供其1年以上的免疫保护作用[19]。李智丽等构建CDV L 株的反向遗传系统，并以之为载体构建表达RV G 蛋白的重组病毒rCDV-RVG，以105TCID50/mL 的剂量免疫犬，二免后CDV 中和抗体水平显著增加，一周内达到峰值，但维持时间较短[20]。而CDV Snyder Hill弱毒疫苗株以较小的免疫剂量(102.5TCID50/mL)便可获得相同的免疫保护作用，其在免疫剂量上的优势可为疫苗后续的生产、使用节约成本，具有较大的经济效益。因此，本研究选用CDV Snyder Hill 疫苗株为载体，构建了一株表达RV G 蛋白的重组病毒rCDV-RVG，为研制高效、安全且价格低廉的二联活载体疫苗提供了数据支持。