2016年～2017年重庆地区禽源大肠杆菌流行病学调查及耐药性分析

陈亚强，廖 明

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510460；2.重庆三峡职业学院，重庆万州404100)

大肠杆菌是环境常见菌，当家禽免疫力降低时可以机会性侵入发病，尤其是当天气寒冷、闷热、禽舍通风不良等恶劣环境下易发大肠杆菌病[1]，该菌侵害机体消化道后出现腹泻，家禽排绿色或黄绿色稀便。重庆市地处我国西南，地貌以丘陵为主，禽饲养总量大，尤其是山区土鸡散养居多。近年来，该地区禽大肠杆菌病的发病率和发病程度均有增长趋势，大肠杆菌病已成为危害该地区养禽业的重要疾病之一[2]。本研究采集2016年～2017年重庆市长寿、万州、梁平、武隆等16 个地区发生腹泻场的禽粪便、环境拭子，通过PCR 鉴定、药敏试验，研究不同地区、不同月份、不同日龄、不同种类、不同品种、不同场别的禽大肠杆菌病流行规律，为指导兽医临床合理用药和防治禽源大肠杆菌病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 788 份样品来自2016年～2017年在重庆长寿、万州、黔江、涪陵、荣昌、合川、江津、南川、綦江、开州、云阳、巫溪、梁平、武隆、酉阳、秀山16 个地区出现腹泻疫情的21 个规模养鸡场、28 个土鸡散养场和1 个鸭散养场，用一次性棉拭子采集病禽肛门粪便和环境样品(饮水、空气、垫料、饲料、禽栏)，共采集粪便拭子188 份(作为数据分析样本)，环境拭子600 份(每个采样点均重复采样1 个)，其中饮水采样点为水源地(贮水地)和饮水槽，空气采样采用平板沉降法，其它采用涂抹采样法。

1.2 主要实验材料 大肠杆菌显色培养基购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒、琼脂凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；ExTaq购自TaKaRa 公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离纯化 将适量生理盐水加入每份粪便拭子收集管及环境拭子收集管后室温振荡混匀，于麦康凯培养基上37 ℃划线培养16 h～18 h，观察菌落生长情况，挑取单个粉红色典型菌落在大肠杆菌显色培养基划线纯化培养。

1.4 分离菌的16S rDNA PCR 鉴定 按照全菌裂解法制备细菌DNA 模板，以其为模板参考文献[3]进行16S rDNA PCR 鉴定，扩增产物由上海美吉生物医药科技公司测序鉴定。

1.5 分离菌的分子分群 参考Clermont 等[4]的方法对分离菌进行分子分群，设计扩增chuA、yiaA和TspE4.C2基因的3 对大肠杆菌分群引物，采用多重PCR 方法进行分群鉴定(图1)。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

图1 判断E.coli 菌株系统进化群的二叉决定树[4]Fig.1 Dichotomous decision tree to determine the phylogenetic group of E.coli using PCR amplification of the chuA, yiaA and TSPE4.C2 genes[4]

1.6 分离菌的药物敏感试验 按照细菌药敏试纸使用说明书，根据K-B (Kirby-Bauer)法测定分离菌株对常用的青霉素、氨苄西林、复方新诺明、诺氟沙星、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、多粘菌素B、头孢噻肟等10 种药物敏感性。

1.7 数据分析 利用SPSS Statistics 19.0 统计分析软件对采集和检测的数据采用T 检验及卡方检验进行显著性分析。

2 结 果

2.1 细菌的分离鉴定 通过麦康凯培养基和显色培养基对788 份样品进行细菌分离，结果显示从粪便拭子中分离到91 株疑似大肠杆菌，从环境拭子中分离到187 株疑似大肠杆菌，经16S rDNA 测序分析显示，共鉴定出93 株大肠杆菌，粪便与环境拭子中分离的大肠杆菌16S rDNA 基因序列吻合度为100%。饮水中大肠杆菌的检出率为19.35 % (18/93)，禽舍空气大肠杆菌的检出率为27.96 % (26/93)，禽栏检出率为95.70 % (89/93)，饲料检出率为22.58 %(21/93)。表明大肠杆菌病疫情与养殖条件密切相关。

chuA、yiaA和TspE4.C2基因检测结果显示，分离的大肠杆菌中A 群占51.61 % (48/93)，B1 群占6.45 % (6/93)，B2 群占12.90 % (12/93)，D 群占29.03 % (27/93)，其中分离的鸭源大肠杆菌均为A群(图2)。表明重庆地区大肠杆菌分离菌以A 群为主，其次是致病性强的B2 群、D 群。

图2 大肠杆菌分群的PCR 鉴定Fig.2 Amplification profiles for phylogenetic groups genes of E.coli by triplex PCR

2.2 不同地区及不同规模饲养场分离菌的检出情况对不同地区、不同规模饲养场样品的分离情况分析结果显示，重庆万州、开州、云阳、巫溪、梁平属于渝东北区，大肠杆菌检出率分别为65 % (13/20)、64.29 % (9/14)、85.71 % (12/14)、72.73 % (8/11)、72.73 % (8/11)，均极显著高于其它地区(p＜0.01)(表1)；綦江、南川、江津、武隆、秀山、酉阳大肠杆菌检出率分别为16.67 % (1/6)、16.67 % (2/12)、28.57 % (2/7)、30 % (3/10)、30 % (3/10)、30 %(3/10)，均极显著低于其它地区(p＜0.01)。表明大肠杆菌分布与地理特征有一定的关系。不同地区散养场大肠杆菌总检出率为58.06 % (36/62)，规模场大肠杆菌总检出率为45.24 % (57/126)(表1)。表明散养场更易存在大肠杆菌，这可能与散养场饲养环境较差有关。

表1 不同地区及不同规模饲养场的大肠杆菌检出情况Table 1 Detcetion of E.coli in different area and farm type

2.3 分离菌在不同月份的检出情况 不同月份的大肠杆菌分离情况分析结果显示，2016年1 月、2 月、6 月检出率分别为66.67 % (8/12)、62.50 % (5/8)、66.67 % (4/6)，均极显著高于其它月份(p＜0.01)；3月、7 月、10 月检出率分别为40 % (4/10)、33.33 %(3/9)、37.50 % (3/8)，均显著低与其它月份(p＜0.01)；12 月检出率为60%(3/5)，显著高于其它月份(p＜0.05)；2017年2 月、8 月、12 月检出率分别为57.14 %(4/7)、60 % (6/10)、70 % (7/10)，均极显著高于其它月份(p＜0.01)；9 月、10 月检出率分别为33.33 %(2/6)、37.50%(3/8)，均极显著低于其它月份(p＜0.01)；4 月检出率为40%(2/5)，显著低于其它月份(p＜0.05)(图3)。表明大肠杆菌检出率季节变化不明显，但个别较冷或较热月份比其它月份检出率高，这可能与夏季天气炎热潮湿适宜细菌增殖、冬季气温低动物抵抗力下降有关。

将不同月份和不同地区大肠杆菌的分离率综合分析显示，6 月、8 月较热月份大肠杆菌检出率高的多集中在丘陵地区(长寿、涪陵、荣昌)，而1 月、12 月较冷月份大肠杆菌检出率高的多在渝东北(巫溪、云阳、开州、万州)、渝东南(黔江、酉阳、武隆)等高山地区(数据未列出)，表明不同的地形、气候与大肠杆菌的检出率有相关性。

图3 不同月份大肠杆菌检出情况Fig.3 Detcetion of E.coli in different months

2.4 分离菌在不同类别、不同品种及不同日龄禽检出情况 不同类别、不同品种、不同日龄禽的大肠杆菌分离情况分析结果显示，鸡源大肠杆菌检出率为52.98 % (89/168)，鸭源大肠杆菌检出率为20 %(4/20)；本地品种大宁河鸡大肠杆菌检出率(12.5 %，3/24)，极显著低于其他品种鸡(p＜0.01)，其中0～5周龄(20 %，2/10)该品种大肠杆菌检出率极显著低于同龄其它品种p＜0.01)，6 周龄～14 周龄(11.11 %，1/9)检出率显著低于同龄其它品种(p＜0.05)；四川麻鸭大肠杆菌检出率(20 %，4/20)显著低于其它品种鸭(p＜0.05)，其中6 周龄～14 周龄四川麻鸭(20 %，1/5)显著低于同龄其它品种鸭(p＜0.05)；0～5 周龄禽(包括鸡和鸭)大肠杆菌的检出率为56.52 % (39/69)、6 周龄～14 周龄禽大肠杆菌的检出率为55.93 %(33/59)、15 周龄～18 周龄禽大肠杆菌的检出率为45.95 % (17/37)，而18 周龄以上禽大肠杆菌的检出率仅17.39 % (4/23)(图4)。表明地方品种大宁河鸡、四川麻鸭大肠杆菌感染率较低，这可能与地方品种更易适应当地环境有关，虽然整个育成周期均易感染，但呈现出周龄越小越易感染的特点。

图4 不同品种及日龄禽类大肠杆菌检出情况Fig.4 Detcetion of E.coli in different breeds and day-age of the chicks and ducks

2.5 分离菌的药敏试验结果 分离菌的药敏试验结果显示，大部分分离菌株表现出多重耐药性(耐3 种药物以上)。3 重耐药菌株占23.66 % (22/93)；4 重耐药菌株占17.20%(16/93)；5 重耐药菌株占12.90%(12/93)；6 重耐药菌株占15.05 % (14/9)；7 重耐药菌株占16.13 % (15/93)；8 重耐药菌株占1.08 %(1/93)；9 重耐药菌株占2.15 % (2/93)；10 重耐药菌株占1.08 % (1/93)。分离菌普遍对诺氟沙星、多粘菌素B、头孢噻肟敏感，对青霉素、氨苄西林、四环素耐药。表明重庆地区大肠杆菌多重耐药现象较严重，主要为3～7 重耐药，多重耐药比高达89.25%(83/93)。

规模场分离菌多重耐药比为91.23 % (54/57)，散养场该比值为86.11 % (31/36)。表明规模场抗生素使用可能较散养场频繁。鸡源大肠杆菌多重耐药比为89.89 % (80/89)，鸭源该比值为75 % (3/4)。不同地区、不同季节、不同禽类别、不同日龄禽分离的大肠杆菌多重耐药比无显著差异(p＞0.05)，而大宁河鸡分离的大肠杆菌多重耐药比为33.33 % (1/3)，极显著低于其它品种(p＜0.01)(表2)。表明从大宁河鸡分离的大肠杆菌对常用药物敏感，可能与大宁河鸡养殖用药少，分离菌未产生广泛耐药性有关。此外，分离的B2 群和D 群大肠杆菌对氨苄西林、链霉素的耐药率均高于A 群和B1 群，对其它抗生素的耐药谱二者无显著差异(p＞0.05)(表2)。表明B2群和D 群大肠杆菌耐药现象更为严重。

表2 分离的大肠杆菌药敏试验结果Table 2 The drug sensitive test of E.coli isolates

3 讨 论

通过调查和检测结果显示，84.46 % (23/26)的空气检出大肠杆菌与同场粪便检出大肠杆菌相似度达90 %以上(数据未列出)，表明粪便中大肠杆菌会通过气溶胶的形式传播，与袁文测得的猪场大肠杆菌气溶胶比例相近[5]，且腹泻病程越久、越严重的禽场，其空气中大肠杆菌检出率越高。致病性大肠杆菌与养殖条件密切相关[6]，本研究中26 个散养场饮水中可以分离到同场粪便样品中的大肠杆菌，而仅有2 个规模场饮水中分离到同场粪便样品中的大肠杆菌，经调查，散养场饮水多为山泉水或蓄水池，饮水消毒不完善，存在安全隐患。在区域对比中，重庆渝东北(万州、云阳、开州、巫溪、梁平)检出率高于其他地区，这与该地区地处秦巴山区，散养场居多有一定关系。大肠杆菌感染无明显季节性，但夏季冬季较为常见[7]，本研究大肠杆菌检出率呈季节变化不明显，但个别较冷或较热月份均比其他月份检出率高。

大肠杆菌B2 群和D 群具有较强的致病性[8]。本研究分离的大肠杆菌B2 群和D 群占41.93 %，临床发病严重的多属于这两个致病群(数据未列)。重庆地区禽大肠杆菌多重耐药现象较为严重，尤其是规模场，大宁河鸡分离的大肠杆菌多重耐药比(33.33%，1/3)极显著低于其他品种，四川麻鸭分离的大肠杆菌多重耐药比(50 %，2/4)显著低于其它品种，这可能与采样场地处山区，呈散养模式有关。

一般情况下，禽大肠杆菌病为生态平衡失调性疾病，当饲养管理不当会引发该病[9]，本研究得到的数据也表明环境因素、饲养管理等与大肠杆菌病的密切联系。因此，防控禽大肠杆菌引起的腹泻应加强养殖场的环境控制和饲养管理，定期合理消毒，尤其是夏季，最好以喷洒和熏蒸消毒搭配，同时加强饮水消毒，越偏远的散养场越应做好这些防控。重庆高山地区还应注意冬季保温，临床用药应以药敏试验为基础选择合适抗生素，在防治过程中采取联合用药、交叉用药以及轮换用药的方式，杜绝滥用、大量使用抗生素。

本研究通过2年时间，对重庆发生腹泻的禽饲养场进行了调查研究，分离鉴定出93 株大肠杆菌，并分析了本地区禽大肠杆菌的分布流行特点，为后续研究和禽大肠杆菌病防控提供研究资料。