我国牛羊流行性出血病血清抗体调查

杨振兴，吕敏娜，朱 沛，杨 恒，肖 雷，廖德芳，谢佳芮，朱建波*，李华春*

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明650224；2.广东省农业科学院动物卫生研究所/ 广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州510640)

流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease，EHD)是通过吸血昆虫库蠓传播的由EHD 病毒(EHDV)引起的一种非接触传染病[1]。该病多发生于反刍动物，特别是北美白尾鹿，致其体温升高，黏膜和浆膜面等多组织广泛出血，并常于昏迷状态下死亡[2]。牛感染该病主要表现为发热、厌食、口腔溃烂出血和一些组织器官坏死，并能引起妊娠期母牛流产和奶牛的产奶量急剧减少[3]。部分羊也能感染该病，主要表现为皮下水肿，眼结膜、心外膜和胃及肠的浆膜面出血，心包囊有黄色液体，鼻子排带绿色黏质物[4]。EHD 危害较大，严重影响着各国畜牧业和国际贸易的发展，OIE 已将EHD 列为法定报告传染病。

EHDV 属呼肠孤病毒科环状病毒属，广泛分布于热带和亚热带地区，目前已知共有8 个血清型，1955年该病毒首次在美国新泽西州的白尾鹿中分离到，随后美洲、非洲、欧洲、澳洲和亚洲的等地区均有报告[5-6]。我国地域辽阔，自然条件复杂，很多地方适于各类宿主动物、吸血节肢动物的生存繁殖及虫媒病毒的存在和传播，虽暂无EHDV 暴发记录，但近年来，在云南、新疆、内蒙古、广西和广东等地的血清学调查中均检出EHDV 阳性抗体，特别是存在对牛有较强致病力的EHDV-2、6 和7 型[7-9]。2015年曹颖颖等在广西分离到EHDV-5 型病毒株[10]，2016年吕敏娜等在广东分离到EHDV-1 型病毒株[11]。表明EHDV 在我国分布广泛，存在暴发该病的风险。为进一步了解EHD 在我国的流行情况，本研究应用竞争ELISA (C-ELISA)方法对2015年～2017年我国吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、新疆、西藏、江苏、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广西和广东15 个省区送检的6 413 份牛羊血清样品进行检测。

1 材料与方法

1.1 血 清 5271 份肉牛、50 份奶牛、912 份山羊和180 份绵羊血清样品由吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、新疆、西藏、江苏、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广西和广东各地相关省、市动物疫病预防控制中心或动物卫生监督所采集送检，均采集自各省区不同养殖场内集约化饲养的动物。

1.2 主要试剂 脱脂奶粉购自BD difco 公司；0.01 mol/L PBS 中加入0.05 %的Tween-20 配制成PBST洗液，PBST 中加入1 %的脱脂奶粉配制成稀释液；EHDV C-ELISA 试剂盒由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供。

1.3 C-ELISA 检测 参照EHDV C-ELISA 试剂盒说明，取出EHDV 抗原固化ELISA 板，每块板均设空白、阳性、弱阳性和阴性对照；每孔加入40 μL 稀释液后，加入10 μL/孔对照和待测血清各2 孔，充分混匀后于37 ℃温育30 min；每孔添加50 μL 竞争抗体，于37 ℃温育30 min；排干液体后加入试剂盒中HRP 酶标抗体50 μL/ 孔，37 ℃温育30 min；PBST 洗板6 次，加入TMB 50 μL/ 孔，避光显色12 min；每孔加入50 μL 1.5 mol/L H2SO4溶液终止反应，测定OD450nm值。

1.4 结果判定 阳性、弱阳性、待测血清样品抑制率(Present inhabitation，PI)%=(阴性对照平均OD450nm值- 样品的平均OD450nm值)×100 %/ 阴性对照平均OD450nm值；弱阳性上限值=1.1×弱阳性对照PI，弱阳性下限值=0.9×弱阳性对照PI。被检样品PI≥弱阳性上限值，判为阳性；被检样品PI≤弱阳性下限值，判为阴性；被检样品的PI 介于上下限之间，进行重复实验，如果结果相同，判为弱阳性。计算分析2015年～2017年各省份不同时间及不同动物血清阳性率，并计算3年各省总血清样品平均阳性率。

2 结 果

2.1 15 省区EHDV 抗体血清学调查结果 对2015年～2017年我国15 个省区送检的5 271 份肉牛、50份奶牛、912 份山羊和180 份绵羊血清进行EHDV C-ELISA 检测(表1)。肉牛、奶牛、山羊和绵羊血清的抗体平均阳性率分别为43.08 %、10 %、0.99 %和0。不同年份同一省区采集的肉牛血清阳性率，2015年和2016年山西分别为4 %和2 %，江苏分别为42 %和39 %；2016年和2017年吉林分别为3 %和0，内蒙古分别为0 和6 %，河北分别为10 %和13.33 %，贵州分别为52.41 %和55.29 %，西藏2年均为0；2015年～2017年3年肉牛血清阳性率重庆分别为27.5 %、26.43 %和31.82 %，云南分别为62.9 %、65.58 %和68.31 %，广东分别为67.5 %、66 %和63.33 %，新疆3年均为0，同一省区不同年份采集的肉牛血清EHDV 抗体阳性率差异不大，表明虫媒病毒与地理生态环境有密切关系。

2.2 我国各省区牛血清EHDV 抗体阳性率分布特点 对15 个省区的数据进行处理，计算各省区3年的牛血清EHDV 抗体平均阳性率。结果显示，该阳性率由北向南、从高纬度到低纬度地区逐渐升高。内蒙古、吉林、辽宁、山西、新疆和西藏6 省阳性率均小于10 %，河北阳性率为11.28 %，重庆阳性率为29.32 %，江苏、四川、湖北和贵州4 省阳性率介于40 %～60 %，云南、广西和广东3 省阳性率均大于60 % (图1)。结果表明，EHD 的流行分布情况与媒介昆虫活动情况呈正相关，主要分布在北纬40°以下，且由北向南感染逐步严重。

2.3 牛、羊血清EHDV 抗体阳性率比较 对7 个省份同一地区采集的牛羊血清样品进行检测。结果显示，无论在牛血清阳性率较高还是较低的地区，山羊和绵羊的血清阳性率均较低。牛血清阳性率最低的内蒙古包头和新疆和田地区，均未发现山羊和绵羊阳性血清；在牛血清阳性率最高的四川、贵州、广东和云南4 省，除广东韶关和云南红河地区有较低山羊血清阳性率(2.5 %和4 %)，其它2 省山羊血清阳性率均为0。河北石家庄地区肉牛和奶牛血清阳性率分别为12 %和10 %，差异不大，但山羊和绵羊血清阳性率均为0 (表2)。表明EHDV 的主要易感动物是牛，而羊并不是主要易感动物。

表1 15 个省份牛羊血清EHDV 抗体检测结果Table 1 Detection of EHDV antibody in cattle, goat and sheep serum in 15 provinces of China

图1 我国15 个省份牛血清样品EHDV 抗体阳性率分布图Fig.1 Distribution of EHDV antibody positive rates of cattle serum samples in 15 provinces of China

表2 各地区不同动物EHDV 抗体阳性率比较Table 2 Difference of EHDV antibody positive rates among cattle, sheep and goat

2.4 不同季节EHDV 抗体阳性率 对云南省德宏、师宗和普洱3 个地区不同季节(3 月～5 月、6月～8月和9月～11 月)采集的牛羊血清进行检测。结果显示，在EHDV 阳性率较高的云南，不同季节阳性率不同，3 个地区牛血清阳性率在春季(3 月～5 月)均最低(10 %～16.67 %)，夏季(6月～8 月)阳性率迅速上升(29 %～32 %)，秋季(9月～11 月)阳性率达到最高均在60 %以上。除德宏地区山羊血清阳性率在夏季(6 月～8 月)和秋季(9月～11 月)为2.86%和3.33%，其它地区3～11 月山羊血清阳性率均为0 (表3)。表明EHDV 的流行和媒介昆虫活动密切相关，有明显的季节性，夏秋两季库蠓活动频繁导致感染率升高，但山羊不是主要易感动物，在不同季节阳性率差异不大。

表3 云南省各地区不同采样时间牛羊血清EHDV 抗体阳性率Table 3 Positive rate of EHDV antibody in cattle and sheep serum at different time

3 讨 论

EHDV 的主要传播媒介是吸血昆虫库蠓，通过雌性库蠓吸吮带毒动物的血液后，病毒在库蠓唾液腺和血腔细胞内增殖，随后从唾液腺中排泌，叮咬易感动物而传播病毒。而库蠓受外界环境温度、湿度和海拔等因素的影响，因此，导致EHD 的流行，具有明显的季节性和地域性特点。

本研究对我国15 个省区2015年～2017年采集的牛羊血清进行血清学调查，结果表明，同一省区不同年份采集的牛血清阳性率差异不大，符合虫媒病毒同地理生态环境有密切关系的特点，当某种病毒的媒介昆虫适应该地区生态环境并生存繁衍下来，该地区就有可能存在其自然疫源地，并相对稳定地长期固定下来。

我国东北和华北地区吉林、辽宁、内蒙古、山西和河北5 省，除河北省EHDV 抗体阳性率为11.28 %，其他省份阳性率均小于10 %，可能是由于该5 省纬度较高，均在北纬40°左右及以上，气候都以温带大陆性季风气候为主，冬季严寒漫长，气温均在0 ℃以下，严重影响和限制了库蠓等媒介昆虫的活动，进而影响了病毒的传播扩散。西北地区新疆409 份牛血清检测均为抗体阴性，可能是因为新疆深居内陆，属温带大陆性气候，常年降水较少，温差较大，冬季寒冷，夏季炎热干燥，春秋季常有沙尘天气，严重影响了库蠓的生存繁殖，导致EHD 感染率很低。华东地区的江苏抗体阳性率为40 %，阳性率较东北、华北和西北地区有较大上升，可能是因为江苏位于北纬30°～35°，纬度比以上地区低，属温带向亚热带过渡性气候，气候温和，雨量适中，媒介昆虫活动频繁所致。除重庆抗体阳性率为29.32 %，华中地区湖北，西南地区四川、贵州和云南，华南地区广西和广东，抗体阳性率均高于50 %，可能和所处纬度更低(北纬30°～20°)，并以亚热带季风气候或热带季风气候为主，年平均气温均在10 ℃以上，比较适合媒介昆虫生存繁殖和活动，导致阳性率最高。由此可见，EHD的流行分布情况与媒介昆虫库蠓活动情况呈正相关，具有明显的地域性，主要分布在北纬40°以下，由北向南感染逐步严重，本次血清学调查结果也验证了这一点。

和云贵川3 省同处于西南地区的西藏，纬度虽小于40° (北纬26°～36°)，但227 份牛血清检测均为抗体阴性，可能由于采样地点，日喀则、拉萨、昌都和阿里地区均位于藏北高原，属典型大陆性气候，年平均气温0 ℃以下，冰冻期长达半年，海拔均在4 000 米以上，媒介昆虫库蠓稀少，导致EHD感染率较低。本研究并未采集藏南地区样品，而藏南谷地受印度洋暖湿气流的影响，温和多雨，年平均气温为8 ℃，后续将对其进行更广泛的采样和检测。

7 个省区内同一地点采集的牛羊血清检测发现，不论在牛血清EHDV 抗体阳性率较高的四川、贵州、广东和云南还是在阳性率较低的内蒙古、河北和新疆，除广东韶关、云南红河地区山羊血清抗体阳性率为2.5 %和4 %，其余地区羊血清均未发现抗体阳性，这可能是由于EHDV 的主要易感动物是鹿和牛，而羊被认为不是易感动物[6]。国外有学者试验证明绵羊可能不被EHDV 感染[12]，但关于山羊是否能被感染的报道较少，2002年有学者在美国的2 头大角羊组织内分离到EHDV[4]，2010年有学者在土耳其发现，在鹅喉羚羊中存在EHDV 抗体阳性血清，阳性率为3.5 %[13]，本研究在云南德宏地区也发现存在很低的山羊血清抗体阳性率(2.86 %～3.33 %)，说明除绵羊外其它羊有可能会被EHDV 感染，但羊并不是主要易感动物。

本研究对云南德宏、师宗和普洱3 地不同季节(3 月～5 月、6 月～8 月、9 月～11 月)采集的牛羊血清进行检测，发现山羊血清抗体阳性率均较低，而牛血清在不同季节抗体阳性率不同，秋季(9 月～11 月)阳性率最高，这可能是由于夏季库蠓活动频繁使感染率升高，抗体转阳高峰推迟到秋季，也可能是由于3 地均处在亚热带或热带地区，秋季(9月～11 月)气温下降不明显，库蠓活动依然频繁所致。进一步验证了EHD 的流行和媒介昆虫活动密切相关，具有明显季节性的特点。

我国地域辽阔，自然条件复杂，南方许多地区属于热带亚热带气候，广泛存在适于各类宿主和吸血节肢动物的生存繁殖及虫媒病毒的存在和传播。本研究通过对我国由北向南15 个省区的牛羊血清进行检测，初步了解了EHD 在我国牛羊中的流行和分布，进一步验证了EHDV 作为虫媒病毒有明显的地域性和季节性特点，为该病的有效防控及进一步了解虫媒病的分布提供了参考依据。